Altering vancomycin susceptibility in vancomycin resistant enterococci by vanH promoter and ddl gene transformation

Abstract

[한글]

반코마이신 내성 장구균은 반코마이신이 결합하는 세포벽 합성의 중간 물질인 D-alanyl-D-alanine 이중펩타이드를 반코마이신과의 결합력이 현저히 저하된 D-alanyl-D-lactate 등의 펩타이드로 대치하여 반코마이신이 결합하지 못하게 하므로써 내성을 나타내게 된다. VanA 표현형 반코마이신 내성 장구균의 반코마이신 내성을 매개하는 Transposon 1546 내의 각 유전자 중 vanH는 D-alanyl-D-alanine 이중펩타이드를 분해하고, vanA는 D-alanyl-D-lactate 연결효소로 전사되어 D-alanyl-D-lactate 펩타이드를 형성한다. 본 연구에서는 유전자 전달을 통해 VanA 표현형 반코마이신 내성 장구균의 반코마이신 감수성을 실험실 내에서 회복시키고자 하였다. VanA 표현형 Enterococcus faecalis 의 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 vanH 프로모터를 포함하는 445 bp의 DNA 절편과 E. faecalis의 ddl 유전자에 해당하는 1074 bp의 DNA 절편을 증폭시켰다. vanH 프로모터를 포함하는 DNA 절편과 pAM401을 각각 제한효소 SalI과 SphI으로 절단하여 T4 DNA 연결효소로 연결시켜 vanH 프로모터를 클로닝한 플라스미드 pJW1을 구성하였다. ddl 유전자에 해당하는 DNA 절편과 pAM401을 각각 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단하여 T4 DNA 연결효소로 연결시켜 ddl 유전자를 클로닝한 플라스미드 pJW2를 구성하였다. ddl 유전자를 플라스미드 pJW1의 vanH 프로모터 3'' 후방에 클로닝하여 플라스미드 pJW3를 구성하였다. VanA 표현형 반코마이신 내성 장구균을 competent cell로 변형시켜 플라스미드 pJW1, pJW2, pJW3을 전기 형질 전환시켰다. Competent E. faecalis와 pJW1, pJW2, pJW3를 형질 전환시킨 재조합 E. faecalis에 대한 반코마이신 최소 억제 농도를 한천 희석법을 이용하여 측정하

였다. Competent E. faecalis와 pJW1, pJW2, pJW3를 형질 전환시킨 재조합 E. faecalis에서 vanA 유전자와 ddl 유전자의 발현 여부를 역전사효소 중합효소 연쇄반응을 이용하여 평가하였다. Competent E. faecalis에 대한 반코마이신 최소 억제 농도는 1024 g/mL 이었다. 플라스미드 pJW1과 pJW3를 형질 전환시킨 E. faecalis에 대한 반코마이신 최소 억제 농도는 256 g/mL 로 감소되었으나 플라스미드 pJW2를 형질 전환시킨 E. faecalis에 대한 반코마이신 최소 억제 농도는 512 g/mL 이었다. vanA 와 ddl 유전자는 competent E. faecalis와 형질 전환시킨 E. faecalis에서 모두 발현되었다.

본 연구는 반코마이신 내성 장구균에서 반코마이신에 대한 내성이 유전자 전달을 통해 부분적으로 회복될 수 있다는 것을 실험적으로 증명하였다. 반코마이신 내성 장구균에서 vanA와 ddl 유전자가 모두 발현되고 있었다. 향후, 효과적인 유전자 전달 체계의 발전이 항생제 내성 균주에서 항생제 치료의 한계를 극복하기 위한 새로운 방법의 개발에 기여할 것으로 생각된다.

[영문]

Background: Acquired resistance to vancomycin in enterococci is due to the production of peptidoglycan precursors ending in D-alanyl-D-lactate instead of D-alanyl-D-alanine. In vancomycin resistant enterococci (VRE) the vanHAXYZ genes encode a new pathway of enzymes that reduce pyruvate to D-lactate (vanH), and

combine D-alanine and D-lactate to produce D-alanyl-D-lactate (vanA). We investigated the effect of vanH promoter and ddl gene transformation on vancomycin susceptibility in a VanA phenotype of Enterococcus faecalis.

Materials and methods: A 445 bp DNA fragment containing the vanH promoter and a 1074 bp fragment containing the putative enterococci ddl gene were amplified by PCR. To construct plasmid pJW1, pAM401 DNA was digested with SalI and SphI and ligated to a DNA fragment carrying a vanH promoter digested with the same enzymes. Plasmid pJW2 was constructed by cloning the BamHI-XbaI fragment of the ddl gene into pAM401 digested with the same enzymes. To construct pJW3, the ddl gene was ligated downstream of the vanH promoter after digestion with BamHI-XbaI and ligation into the same site of the plasmid pJW1 digested with same enzymes.

Electrotransformation of the competent VanA phenotype E. faecalis with pJW1, pJW2 and pJW3 was accomplished with a Bio-Rad Gene Pulser. The minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin for E. faecalis and E. faecalis transformed with pJW1, pJW2, and pJW3 was determined using the broth dilution method. The expressions of the vanA and ddl genes of the VanA phenotype of E. faecalis and transformed E. faecalis were evaluated by RT PCR.

Results: The vancomycin MIC for competent E. faecalis was 1024 g/mL, for E. faecalis transformed with pJW1 and pJW3 this was reduced to 256 g/mL, and the vancomycin MIC for E. faecalis transformed with pJW2 was reduced to 512 g/mL. RT PCR revealed that the vanA and ddl genes of VRE and E. faecalis transformed with pJW1, pJW2, and pJW3 were expressed.

Conclusion: This study presents a way of altering high-level vancomycin resistance with gene transformation in enterococci. The vanA and ddl gene were expressed in the vancomycin resistant E. faecalis. In the future, development of an effective gene delivery system will probably contribute to the design of new modalities that will help overcome the limitations of antimicrobial therapy.