Analysis of genes related to the cell cycle in the pancreatic cancer using cDNA microarray

Abstract

[한글]

췌장암은 5년 생존율이 5% 미만으로 예후가 매우 불량한 암이다. 진단 당시에 80% 이상의 환자가 진행성 또는 전이성 상태로 발견되고, 진행된 췌장암의 경우 효과적인 치료법이 없다. 또한, 조기 진단을 위한 검사방법이 없다. 따라서, 췌장암은 조기진단이 절실히 요구된다.

암의 성장과 발생은 다단계로 구성되어 있는데, 각 단계마다 유전적 변이가 일어나고 이러한 변이의 축적은 정상조직을 악성 종양으로 변화시킨다. 췌장암에서도 이와 유사하게, 수많은 유전적 변이가 발견되고 있다. 암을 유발하는 유전자를 종양억제유전자, 종양발생유전자, DNA mismatch repair유전자 세 그룹으로 나눌 수 있다. 이러한 유전자들은 종양세포의 외부 혹은 내부에 있는 조절자의 발현을 변화시켜 세포주기의 checkpoint를 폐지하여 세포가 반복적으로 세포주기를 통한 세포분열을 하도록 유발하고, 결과적으로 악성종양을 발생시킨다.

본 실험은 췌장암에서 발현이 조절된 여러 유전자들 중에서 세포주기와 연관된 유전자의 발현을 알기 위해 계획 되었고, cDNA microarray를 이용하였다. 실험은 Affymetrix GeneChip을 사용하였고 동일회사의 실험방법을 따랐다. RNA를 추출하기 위해 췌장암조직과 정상췌장조직을 수집하였다. cDNA microarray를 통해 나온 자료는 Gene Logic사의 통계처리 프로그램으로 유의한 자료를 추출한 후 NCBI database인 LocusLink를 검색하여 세포주기 관련 유전자를 찾았다. 개개의 유전자에 대한 정보는 PubMed 검색을 이용하였다.

892개의 유전자가 정상 췌장조직에 비해 췌장암에서 과(過)발현 되었으며 (P < 0.0001), 1092개의 유전자가 췌장암에서 저(低)발현 되었다 (P < 0.001). 정상 췌장조직에 비해 10배 이상 과발현 된 유전자는 59개(6.6%)로 이며, 정상 췌장조직에 비해 10배 이상 저발현 된 유전자는 88개(8.1%)이었다. 과발현 된 892개의 유전자 중에서 세포주기에 관련된 유전자는 모두 30개였으며, 1092개의 유전자 중에서 25개의 유전자가 세포주기와 연관되었다. 췌장암에서 총 55개의 세포주기 관련 유전자가 밝혀졌으며, 이의 확인을 위해 인터넷을 통한 문헌 고찰을 시행하였고, 10개의 유전자가 췌장암과 관련되었다는 것을 확인하였다. 45개의 유전자는 본 실험에서 처음 발견되었다. 또한, 55개의 유전자 중에서 8개의 유전자가 apoptosis와 관련이 있었다. cDNA microarray 결과의 유효성(validation)을 검증하기 위해 dynein과 clusterin에 대한 RT-PCR과 Western blot을 시행하였고, cDNA micrarray 와 동일한 결과를 얻었다.

cDNA microarray는 한번의 실험으로 동시에 수천 개의 유전자의 발현형태를 알아낼 수 있다. 현재 많은 연구에서 이를 이용하여 다른 조직 간의 비교발현형태를 분석하고 있다. 본 연구도 췌장암과 정상 췌장의 유전자 발현을 비교하고 그 자료를 분석하여, 세포주기와 관련된 암의 발생기전을 이해하고, 새로운 치료전략이나 새로운 종양표지 인자를 찾기 위한 계획의 일부분이다.

본 연구에서는 RNA를 추출하기 위해 조직을 사용하였는데, 이는 기존의 세포에서 RNA를 추출하는 연구와 달리, 종양과 기질의 상호관계를 포함하는 췌장암 조직의 통합적인 유전자의 발현을 알 수 있으므로, in vivo와 유사한 환경에서의 유전자 발현을 알 수 있다. 췌장암 조직의 기질에는 섬유아세포, 내피세포, 정상 췌장실질세포, 염증세포 등이 포함되어 있으며, 이들의 상호관계가 조직학적으로 췌장암을 구성하므로 조직전체의 유전자 발현을 연구하는 것이 타당하다고 생각된다.

본 연구에서는 기존의 문헌에 보고되지 않은, 매우 높게 발현된 유전자가 많이 발견되었고, 세포주기와 관련된 알려지지 않은 45개의 유전자가 발견되었는데, 이 결과를 통해 좀 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.

[영문]

Pancreatic cancer is one of the most malignant gastrointestinal tumors and has an overall five-year survival rate of less than 5%. The low survival rate is due to the advanced stage at the time of diagnosis, when more than 80% of pancreatic cancers are metastasized or locally advanced. There is urgent need for adequate screening tests that can identify people at high risk of developing pancreatic cancer. The development and growth of cancer are a multi-step process including initiation, progression, invasion, and distant metastasis. Each of these steps involves multiple genetic alterations. A common feature of cancer cells is the abrogation of cell cycle checkpoints, either by aberrant expression of positive regulators or the loss of negative regulators. We analyzed a large set of surgically resected pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissues using cDNA microarray. Microarray procedure was performed according to methods described in the Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual.

We identified 892 genes to be expressed at least twofold more in pancreatic cancer than in normal pancreatic tissues. And we identified 1092 genes that were repressed at least twofold in pancreatic cancers. Through the literature search, we found that, of 892 overexpressed genes in pancreatic cancer tissues, 30 genes were associated with cell cycle, and 25 of 1092 repressed genes participated in cell cycle. The total 55 genes were the regulators of cell cycle in pancreatic cancers. Then, we found that 10 of 55 genes were previously reported to be associated with the pancreatic cancer, but 45 were novel genes, which had never been reported on the expression in the pancreatic cancer.

The expression profile of a large number of overexpressed and repressed genes in pancreatic adenocarcinomas was identified in this study. These gene expression patterns in pancreatic cancer tissues by cDNA microarray analysis will provide validation of many genes with promise for the development into potential novel therapeutic or diagnostic targets, and also provide clues to additional genes and cellular pathways that may play a role in the cancer biology.