Retroviral vector를 이용한 Herpes Simplex Virus-thymidine kinase 유전자의 형질도입이 간암 세포의 Ganciclovir 감수성에 미치는 영향

Abstract

[한글]

Herpes Simplex Virus-thymidine kinase(HSV-tk) 유전자는 bacterial cytosine deaminase 유전자와 같이 대표적인 약제 감수성(suicide) 유전자로, HSV-tk 유전자의 산물의 경우 guanosine analogue인 Ganciclovir(GCV)를 DNA 합성을 중단시킬 수 있는 중간 대사물로 전환시켜 세포사를 유도한다. 지금까지 HSV-tk 유전자 도입 및 발현을 통한 치료 효과가 기대되는 암으로는 악성 림프종, 신경교종, 섬유육종, 악성 혹색종 등이 보고되고 있으나, 우리나라에서 빈번하게 발생하는 간암에 대해서는 아직 유전자 요법을 위한 연구가 미흡한 실정이다.

본 연구에서는 HSV-tk 유전자를 함유하는 재조합 레트로 바이러스(LNC/HSV-tk)를 제조한 후 이를 이용하여 HSV-tk 유전자를 간암 세포주에 형질 도입하여 in vitro 및 in vivo에서 항바이러스제인 Ganciclovir(GCV)에 대한 간암 세포주의 감수성의 변화 여부를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 간암 모세포주와 각각의 모세포에 HSV-tk 유전자가 형질도입 된 간암 세포주(SK-Hep1/HSV-tk, Hep-3B/HSV-tk)에서 GCV에 대한 감수성을 비교하였을 때 두 종류의 간암 세포주 모두에서 HSV-tk 유전자가 형질도입 된 경우 GCV 농도에 비례하여 감수성이 증가하는

것을 관찰할 수 있었다(각각 p< 0.001), 그러나 HSV-tk 유전자를 형질도입하지 않은 간암 모세포주의 경우는 GCV를 500 ㎍/㎖ 이상의 높은 용량으로 투여하였을 때 약간의 세포성장억제를 관찰할 수 있었으나, 이보다 적은 용량에서는 세포 성장의 억제가 뚜렷하지 않았다.

2. 누드 생쥐의 양측 복벽에 각각 총 10**7 개의 간암 세포주를 주사한 후 GCV를 투여할 때 HSV-tk 유전자가 형질도입 되지 않은 간암 모세포주(Hep-3B)에 의한 종괴는 지속적인 성장을 보였었다. 반면 HSV-tk 유전자가 형질도입 된 세포와 도입되지 않은 간암 세포주를 여러 가지 비율로 혼합하여 누드 생쥐에 접종한 후 GCV를 투여하였을 때 형질 도입된 세포의 비율이 100%, 70%, 50%를 차지하는 경우에는 실험 대상 누드 생쥐 12 마리 중 1 마리에서, 그리고 형질도입 세포의 비율이 30%인 경우는 대상 생쥐 6 마리 중 1 마리에서, 10%인 경우에는 6 마리 중 5 마리에서 각각 종괴의 성장을 관찰할 수 있었다.

3. 누드 생쥐에 간암 세포 접종 후 GCV 투여가 누드 생쥐의 생존에 미치는 영향을 관찰하였을 때 누드생쥐의 양측 복벽에 주사한 간암 세포 중 HSV-tk 유전자 함유 세포의 비율이 각각 50%와 70%를 차지하는 B군의 경우 실험 대상 생쥐 6 마리 중 1 마리에서 종괴의 성장을 보이면서 중앙 생존 기간은 180+일 이었으며, HSV-tk 유전자 함유 세포 비율이 각각 100%와 0%이었던 A군은 0%를 주사한 부위에서 지속적인 종괴의 성장을 보이면서 중앙 생존 기간 55일, 그리고 HSV-tk 유전자 함유 세포 비율이 각각 30%와 10%이었던 C군은 A군의 0% 주사 부위에 비하여 종양의 더딘 성장을 보이면서 중앙 생존 기간은 82일로 유의한 차이를 보였다 (p < 0.001).

이상의 결과에서 인체 간암 세포에 레트로 바이러스를 이용하여 HSV-tk 유전자를 형질도입 하여 GCV에 대한 감수성의 변화 여부를 관찰한 결과 in vitro 및 in vivo에서 GCV에 대한 감수성의 증가를 관찰할 수 있었다. 누드생쥐에서 bystander effect의 검증을 위해 HSV-tk 유전자를 형질도입한 세포와 형질도입하지 않은 간암 모세포주를 혼합하여 접종한 후 GCV를 투여하였을 때, HSV-tk 유전자가 형질도입 된 간암 세포의 비율이 30%를 넘을 때 비교적 만족스러운 항 종양효과를 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 HSV-tk/GCV 유전자 치료법의 임상 시도의 당위성이 있다고 생각되나 HSV-tk/GCV 유전자 치료가 더욱 효과적으로 시행되기 위해서는 gap junction의 발현 정도와 HSV-tk/GCV 유전자 치료시의 효과와의 상호관계규명에 대한 연구가 또한 필요하리라고 생각된다.

[영문]

Herpes simplex virus-thymidine kinase(HSV-tk) gene is a representative drug susceptibility(suicidal) gene together with the bacterial cytosine deaminase gene. HSV-tk gene product induces cell death by transformation of ganciclovir(GCV), a guanosine analogue, to an intermediate that interferes with DNA synthesis.

In this study we transduced HSV-tk gene into the hematoma cell line(SK-Hep1, Hep-3B) and tested alteration of susceptibility to the anti-viral agent GCV in vitro and vivo. The results are as follows.

1. In comparison of susceptibility to various concentrations of GCV in hepatoma cell lines(SK-Hep, Hep-3B) after transduction of HSV-tk gene, we observed increasing susceptibility in proportion to the concentration of GCV in both hematoma cell lines transduced with the HSV-tk gene(p<0.001). But in hematoma cell lines that were not transduced with the HSV-tk gene, we observed some suppression of cell growth by GCV at the concentration of more than 500 ㎍/㎖, without any effects at lower than that concentration.

2. After implantation of 10**7 hepatoma cell line into both flank of nude mice and administration of GCV, we observed continuous tumor growth in the cells that were not transduced by the HSV-tk gene. But after implantation of the mixture of hematoma cell lines in various ratios of cells transduced with the HSV-tk gene and of cells that were not transduced with the HSV-tk gene, administration of GCV resulted in tumor growth in 1 of 12 nude mice at ratios of 100%, 70% and 50% of transduced cells. When transduced cell ratio was 30%, tumor growth appeared in 1 of 6 and 5 in 6 at ratio of 10%.

3. In group B, implanted cell lines contained 50% and 70% of HSV-tk gene transduced cells, tumor growth appeared in 1 of 6 nude mice and the median survival was 180+ days. In group A, implanted cell lines contained 100% and 0% of HSV-tk gene transduced cells, there was continuous tumor growth at the lesion containing 0% HSV-tk gene transduced cells, and the median survival was 55 days, In group C, implanted cell lines contained 30% and 10% of HSV-tk gene transduced cells, there was slower tumor growth than A at the lesion containing 0% HSV-tk gene transduced cells, and the median survival was 82 days. Significant difference in the median survival between group A, B, and C was shown(P < 0.001).

Based on these results, in human hematoma cell lines transduced HSV-tk genes with retrovirus, we observed increased susceptibility to ganciclovir in vitro and in vivo. To verify the bystander effect in nude mice, implantation of the mixture of hepatona cell lines in various ratios of cells transduced with the HSV-tk gene and cells not transduced with it was performed and followed by the administration of GCV. We found satisfactory anti-tumor effect of HSV-tk transduction dependent-GCV administration at ratio of more than 30% of the HSV-tk gene transduced cells. In conclusion, the preceeding results suggest a possibility of a clinical trial of HSV-tk/GCV gene therapy, but more studies are required to justify the effective relationship between the expression of gap junction and HSV-tk/GCV gene therapy.