Functional characterization of a novel POK family transcription factor, ZBTB5, in the transcriptional regulation of cell cycle arrest p21CIP1 gene

Abstract

[한글]인간 게놈 프로젝트를 통해 알려지게 된 많은 유전자들은 최근 기능

동정을 중심으로 많은 연구가 진행되고 있다. 이 계열의 단백질은

단백질-단백질간의 상호작용 모티프로 작용하는 BTB/POZ domain을

가지며 다양한 세포기능 조절에 관여한다. 세포 기능조절 단백질은 수십-수백 개의 아미노산으로 구성된 조각(모듈: module)로 구성되어 있으며, 모듈을 중심으로 일어나는 단백질-단백질 상호작용에 의하여 고유의 기능을 발휘한다. 주로 POZ-도메인을 갖는 단백질들은 세포 죽음, 염색체 구조조절, 암 발생, 유전자 발현조절 등에 관련되어 있다. 이에 우리 팀은 BTB/POZ 도메인중 하나인 ZBTB5를 분리, 동정하였으며, RT-PCR을 통해 생쥐에서 심장과 갈색지방을 제외한 거의 모든 조직에서 ZBTB5가 발현되고 있음을 확인하게 되었다. SAGE 분석 결과 안암과 근육암에서 ZBTB5의 발현량이 현저하게 증가되어 있음을 알 수 있다. 최근 BTB/POZ 도메인 단백질 중 하나인 FBI-1이 세포주기를 촉진시킨다는 보고로 proto-oncogene으로서 주목을 받고 있는데, 우리는 아마도 ZBTB5 역시 세포주기에 관계되는

Arf-Mdm2-p53-p21의 promoter에 영향을 끼칠 것으로 예상하고

luciferase assay를 실시하였다. 흥미롭게도 p53 경로의 하위단계

조절인자인 p21의 전사만 억제하는 것을 관찰하였다. 이는 상위단계의

조절여부와는 상관없이 하위단계 인자를 조절하게 때문에 세포주기 조절에 기여하는 바가 크다고 판단하여 p21의 전사를 억제 하는 ZBTB5의 작용기전을 연구하였다.

ZBTB5 는 직접적으로 세포주기 조절인자인 p21 유전자 프로모터의

근접조절 부위의 GC Box 5/6 번 자리와 Distal 부위의 p53 결함부위에

징크핑거를 통하여 결합하여 p21 의 발현을 감소시킴을 GST pull- down, EMSA, ChIP을 통하여 밝히었다. 또한, 기존의 알려진 p53과 Sp1 과의 관계는 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation Assay)를 통해 p53과는 결합자리를 두고 경쟁하며, Sp1의 결합은 증가시킴을 알 수 있었다. 이와 같은 방법으로 ZBTB5는 POZ와 징크핑거 도메인을 통하여 corepressor 히스톤 디아세틸 복합체 중 BCoR, NCoR 그리고 SMRT와 상호작용을 하는 것으로 나타났고 최종적으로 p21 프로모터 근접조절 부분의 히스톤을 디아세틸화 시킴으로써 전사를 억제시킨다. 이러한 전사 억제효과가 세포기능 조절에 어떠한 영향을 미치는가를 관찰하기 위하여 MTT 와 FACS 분석을 실시하였다. 그 결과 ZBTB5가 세포성장과

세포주기의 조절에 중요하며 특히, 세포주기중 S 기의 세포수가 현저히 증가함을 관찰하였다.

결과적으로, ZBTB5는 세포주기를 멈추게 하는 p21 의 발현을

감소시킴으로써 세포의 증식을 촉진할 수 있는 원암 유전자의 성격을

가지고 있음을 발견하였다

[영문]Transcriptional repression through chromatin remodeling and histone deacetylation has been postulated as a driving force for tumorigenesis. We isolated and characterized a novel POZ domain Kruppel-like zinc finger transcription repressor, ZBTB5 (zinc finger and BTB domain-containing 5). Serial analysis of gene expression (SAGE) analysis showed that ZBTB5 expression is higher in retinoblastoma and muscle cancer tissues. Immunocytochemistry showed that ZBTB5 was localized to the nucleus, particularly nuclear speckles. ZBTB5 directly repressed transcription of cell cycle arrest gene p21 by binding to the proximal GC-box 5/6 elements and the two distal p53-responsive elements (bp -2323 ~ -2299; bp -1416 ~ -1392). Chromatin immunoprecipitation assays showed that ZBTB5 and p53 competed with each other in occupying the p53 binding elements. ZBTB5 interacted with corepress or histone deacetylase complexes such as BCoR (BCL-6-interacting corepressor), NCoR (nuclear receptor corepressor), and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid receptors) via its POZ domain. These interactions resulted in deacetylation of histones Ac-H3 and Ac-H4 at the proximal promoter, which is important in the transcriptional repression of p21. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assays and fluorescent-activated cell sorter analysis revealed that ZBTB5 stimulated both cell proliferation and cell cycle progression, significantly increasing the number of cells in S-phase. Overall, our data suggest that ZBTB5 is a potent transcription repressor of cell cycle arrest gene p21 and a potential proto-oncogene stimulating cell proliferation.