한국산 집먼지 진드기 전충체 조항원에서 알레르겐의 표준화

Abstract

[한글]

집먼지 진드기는 알레르기 피부 반응검사, 특히 IgE 항체의 검출 및 특이 기관지유발검사를 통하여 기관지 천식을 비롯한 알레르기 질환의 가장 중요한 원인으로 알려저 있다. 우리나라도 최근 알레르기 질환이 증가하고 있으며 알레르기 환자의 50-80%가 집먼지 진드기로 시행한 알레르기 피부반응 검사에 강양성 반응을 보이며 이들의 2/3에서 특이 IgE 항체가 검출되며, 특이 IgE 항체를 가진 기관지 천식환자에서 집먼지 진드기 항원으로 기관지 천식 유발검사를 시행하면 조기, 후기 또는 이중 천식반응이 나타나며 이 반응의 양상은 집먼지 진드기의 특이 lgE 항체양과 관련성이 많은 것으로 보고되었다. 그러나 외국에서 들여온 집먼지 진드기 항원과 외국산 집먼지 진드기 전충체 추출물로 시행한 연구결과는 엄밀한 의미로는 우리나라 항원에 대한 알레르기 반응의 연구결과라고 할 수 없는 실정이다. 알레르기성 질환의 발생에 환경요소가 매우 중요한 인자로 작용하기 때문에 우리나라 알레르기 질환의 원인으로 가장 긴밀하게 관여하는 집먼지 진드기에 대한 한국산 알레르겐을 제조하고 그것에 대한 면역반응을 연구하는 것은 매우 의미가 있다고 생각된다.

이에 본 연구에서는 우리나라 집먼지에서 채집하여 순수 계대 번식 사육한 두종의 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae 및 Dermatophagoides pteronyssinus)의 전충체 조항원에 대한 알레르겐의 함량을 정량화하고 구성성분을 분석하며 피부 단자시험 및 피내시험을 통하여 알레르기성을 평가함으로써 제조 집먼지 진드기 조항원에 대한 알레르겐의 표준화를 시행하여 in-house reference로 삼으며 이의 임상적용 즉, 알레르기 질환의 진단 및 치료에 있어서 국산 알레르겐 이용에 대한 타당성을 알아보고자 하였다.

1. 우리나라 집먼지속에 서식하고 있는 진드기중 우점종인 Dermatophagoides farinae(D. farinae) 및 Dermatophagoides pteronyssinus(D. pteronyssinus) 두종을 계대배양하고 대량사육한 후 알레르겐 추출과정을 거쳐 냉동건조 분말을 얻었다. 냉동건조 전충체 조항원 단위무게당 단백질 함량을 측정한 결과 D. farinae 1mg당 5607g,7.7r7r7nyf7inHf 1mg당 6807g의 단백질이 포함되어 있었다.

2. 단크론 항체를 이용하여 조항원내의 주요 알레르겐을 정량한 결과, 냉동건조 D. farinae 조항원 1㎎당 Der fⅠ 34.6㎍, Der f Ⅱ 17.0㎍이 포함되어 있었으며, 냉동건조 D. pteronyssinus 조항원 1㎎당 Der p Ⅰ 21.0㎍, Ser p Ⅱ 18.6㎍이 포함되어 있었다.

3. 항원의 구성성분을 알아보고자 시행한 SDS-PAGE상 분자량 14-120kDa 사이에 고르게 단백분획이 있음이 관찰되었으며 immunoblotting 상 특이 IgE 항체와 결합하는 group Ⅱ 알레르겐을 포함하여, 특이 IgE 항체와 결합하는 많은 단백분획이 관찰되었다.

4. ELISA 억제시험상 두종의 전충체 조항원 모두에서 용량-의존형 억제반응을 보여 항원의 특이성을 관찰할 수 있었으며 D. farinae는 0.19㎍에서, D. pteronyssinus는 0.08㎍에서 50% 억제되었다.

5. 120명의 환자를 대상으로 두종의 조항원을 각각 세가지 서로 다른 농도로 피부단자시험을 시행한 결과 D. farinae는 1:1,500w/v 희석액에서 히스타민 1㎎/ml과 같은 팽진의 크기를 나타내는 1,000 Biologic unit(BU)/ml로 나타났으며 D. pteronyssinus는 1:1,000w/v에서 1,000 BU/ml로 나타났다.

6. 피부 단자시험상 두종의 진드기에 대하여 강양성 반응을 보인 30명의 환자를 대상으로 각각 1:100w/v의 항원액을 3배씩 15번째까지 희석하여 시행한 피내 피부검사상 두종 모두 1:100w/v이 100,000 Allergy unit(AU)/ml로 나타났다.

7. 137예의 환자를 대상으로 제조된 D. farinae 5,000 BU/ml로 시행한 피부 단자시험의 양성 및 음성 결과를 ELISA 방법으로 측정한 특이 IgE 항체의 양, 음성 여부와 비교한 결과 민간도 78.1%, 특이도 77.2%(Bencard사 제품 D. farinae는 민감도 73.7%, 특이도 78

.7%)를 나타냈으며 D. pteronyssinus 5,000 BU/㎖는 민감도 81.2%, 특이도 72.1%(Bencard사 제품 D. pteronyssinus는 민감도 76.8%, 특이도 85.3%)를 보였다.

이상의 결과로 제조 집먼지 진드기 전충체 조항원에는 비교적 많은 양의 주요 알레르겐이 포함되어 있으며 피부검사시 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 추후 임상응용에서 보다 좋은 검사성적을 얻을 수 있는 알레르겐 추출과정 및 임상적용에 대한 연구가 필요할 것으로 사료되며 이를 통하여 진단 및 치료용 알레르겐의 국산화가 가능할 것으로 기대된다.

[영문]

House dust mites have been known as the most important allergen in respiratory allergic disease. By numerous in vivo and in vitro studies, Dermatophagoides farinae(D. farinae) and Dermatophagoides pteronyssinus(D. pteronyssinus) have been recognized as the most important species among family Pyrogliphidae in Korea. Since environmental factors may have influences on the pathogenesis of allergic disease, study using Korean house dust mites for the immune and biologic reactions of house dust mite-sensitive allergic disease is considered as significant. Thus we made in-house two Korean house dust mites(D. farinae and D. pteronyssinus) allergenic extracts and performed this study for the allergen standardization by in vitro and

in vivo methods and for the evaluation of the reliabilities of the clinical application.

1. There were 560㎍ and 680㎍ of proteins in 1㎎ of each lyophilized D. farinae and D. pteronyssinus whole body allergenic extracts. In major allergen quantification using house dust mite specific monoclonal antibodies, there was 34.6㎍ of Der f Ⅰ and 17.0㎍ of Der f Ⅱ allergen in 1㎎ of lyophilized D. farinae

extract, and 21.0㎍ of Der p Ⅰ and 18.6㎍ of Der p Ⅱ allergen in 1㎎ of lyophilized D. pteronyssinus allergenic extracts respectively.

2. Evenly distributed many allergenic components including major allergen were identified by SDS-PAGE and immunoblot analysis.

3. Both D. farinae and D. pteronyssinus were seen as dose-dependent inhibition pattern by ELISA inhibition test. The amounts of allergen for the fifty percent inhibition was 0.19㎍ of D. farinae and 0.08㎍ of D. pteronyssinus.

4. The activity of 1:1,500w/v of D. farinae and 1:1,000w/v of D. pteronyssinus were considered 1,000 Biology unit(BU) as a results of biologic standardization using skin prick test techniques, and 1:100w/v of both D. farinae and D. pteronyssinus were 100,000 allergy unit(AU) as a results of intradermal biologic standardization

5. Similiar diagnostic sensitivies and specificies were seen at the skin prick test with in-house made house dust mite extracts compared to the results of widely used commercial allergenic sample.

In conclusion there were relatively large amounts of major allergen in in-house made house dust mite whole body extracts and showed good allergenic activities both in vitro and in vivo. Thus it is considered as clinically useful and reliable allergenic extracts.