Simultaneous profiling of chromatin states and transcriptome at single-cell resolution using nanobody-based CUT&Tag

Abstract

A comprehensive understanding of the interplay between chromatin states and gene expression is essential for elucidating gene regulatory networks in complex tissues. Traditional bulk sequencing approaches obscure cellular heterogeneity, while early single-cell methods, limited to profiling either transcriptomic or epigenomic modalities alone, have provided incomplete insights into multilayered gene regulation mechanisms. CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) has emerged as a revolutionary alternative to conventional ChIP-seq, enabling high-resolution chromatin profiling with significantly reduced cellular input requirements. Recent advancements, particularly NanoCUT&Tag technology utilizing nanobody-Tn5 fusion proteins, have further enhanced sensitivity and specificity, simplified experimental workflows, and facilitated simultaneous profiling of multiple histone modifications at single-cell resolution. In this study, a scalable and precise multimodal analysis technology was established based on NanoCUT&Tag for the simultaneous profiling of H3K27ac-marked active chromatin states and transcriptomes from single nuclei. Optimization of nanobody-Tn5 enzyme concentrations and adaptor ratios was first performed for effective H3K27ac profiling in the colorectal cancer cell line HCT116. Subsequently, these optimized conditions were adapted to single-nucleus resolution through a combinatorial indexing strategy, enabling high-throughput single-cell analysis without the use of microfluidic systems. The experimental workflow was further extended to allow concurrent capture of H3K27ac-marked chromatin and RNA transcripts from the same nucleus, resulting in reproducible and high-quality multimodal datasets. Application of this integrated methodology to adult mouse hippocampal tissue, characterized by significant cellular heterogeneity, enabled classification of distinct neuronal and non-neuronal cell types based on combined histone modification and transcriptomic profiles. Integrated analysis demonstrated the capability to identify regulatory elements potentially driving cell-type-specific gene expression programs. Collectively, the multimodal profiling technology established in this study provides a robust, scalable, and widely applicable approach for integrated analysis of histone modifications and gene expression at single-cell resolution. This strategy offers valuable opportunities for exploring cell fate decisions, transcriptional regulatory mechanisms, and disease-associated molecular pathways within diverse and complex biological systems.크로마틴 상태와 유전자 발현 간의 상호작용을 포괄적으로 이해하는 것은 복잡한 조직 내 유전자 조절 네트워크를 규명하는 데 필수적이다. 기존의 벌크 시퀀싱 기법은 세포 간 이질성을 평균화함으로써 세포 특이적인 정보를 소실시키며, 초기 단일세포 분석 기술은 전사체나 후성유전체 중 하나의 단일 오믹스만을 분석하여 유전자 조절의 다층적 메커니즘에 대한 불완전한 통찰만을 제공하였다. 최근 등장한 CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation) 기술은 적은 수의 세포만으로도 고해상도 크로마틴 프로파일링을 가능하게 하며, 기존 ChIP-seq을 대체할 수 있는 혁신적 방법으로 주목받고 있다. 특히 나노바디-Tn5 융합 단백질을 활용한 NanoCUT&Tag 기술은 감도와 특이성을 향상시키고, 실험 과정을 단순화하며, 단일세포 수준에서 여러 히스톤 변형을 동시에 분석할 수 있다. 본 연구에서는 NanoCUT&Tag를 기반으로 한 확장 가능하고 정밀한 멀티모달 분석 기술을 구축하여, 단일 핵 수준에서 H3K27ac으로 표지된 활성 크로마틴 상태와 전사체를 동시에 분석하였다. 이를 위해 대장암 세포주 HCT116에서 나노바디-Tn5 효소 농도와 어댑터 비율에 대한 최적화를 수행하였으며, 조합 색인(combinatorial indexing) 전략을 적용하여 마이크로플루이딕스 장비 없이 고처리량 단일세포 분석이 가능하도록 하였다. 또한, 동일한 핵에서 RNA 전사체까지 함께 획득할 수 있도록 실험 프로토콜을 확장함으로써 크로마틴 활성과 유전자 발현 정보를 모두 반영한 고품질 멀티모달 데이터를 확보하였다. 이 통합 분석 기술은 이질성이 높은 성체 생쥐 해마 조직에 적용되어, 히스톤 변형과 전사체 정보를 통합 분석함으로써 신경세포 및 비신경세포 등 다양한 세포 유형을 분류할 수 있었고, 세포 유형 특이적 유전자 발현을 유도하는 조절 요소(regulatory elements)를 식별할 수 있음을 보여주었다. 종합적으로, 본 연구에서 확립한 NanoCUT&Tag 기반 멀티모달 분석 기술은 단일세포 수준에서 히스톤 변형과 유전자 발현을 통합적으로 분석할 수 있는 견고하고 확장 가능한 전략을 제시하며, 세포 운명 결정, 전사 조절 메커니즘 및 질환 관련 분자 경로 연구에 폭넓게 활용될 수 있을 것이다.