Evaluation of hemostatic agents containing aluminum chloride: From in vitro studies to clinical outcomes in endodontic microsurgery

Abstract

The aims of this study were (1) to evaluate cytotoxicity of aluminum chloride containing hemostatic agents, Expasyl (Pierre Rolland, Merignac, France) and Traxodent (Premier Dental, Plymouth, PA, USA), on human osteoblasts (HOBs, Promocell, Hidelberg, Germany), (2) to investigate their hemostatic efficacy and tissue reaction in standardized bone defects of rabbit calvaria, and (3) to assess their effects on outcome of apical surgery in a randomized controlled trial. In in vitro assessment, cell viability of HOBs cultured in high and low concentration of material extract medium was evaluated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8). The expression levels of osteogenic specific gene alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OCN), and runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and inflammatory specific gene interleukin (IL)-6, IL-8, and transforming growth factor (TGF)-β were analyzed by Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). In in vivo study, six round bone defects were surgically created in the calvaria of six New Zealand rabbits. The defects in each rabbit were randomly assigned to one of the following 6 groups: control, epinephrine impregnated cotton with pressure, Expasyl with curettage and saline irrigation, Expasyl with saline irrigation only, Traxodent with curettage and saline irrigation, and Traxodent with saline irrigation only. All hemostatic agents were applied for 2 minutes and removed accordingly. Three examiners evaluated and scored the amount of bleeding prior to and following the application of hemostatic agents by analyzing photographs taken during surgical procedures. Hemostatic efficacy was then determined by the difference in mean initial and final bleeding score. Histological analysis was conducted on the samples using two staining methods: Hematoxylin and eosin (HE) and Masson-Goldner trichrome. These techniques were employed to assess tissue responses and bone regeneration in relation to hemostatic agents applied. A clinical investigation was structured as a randomized controlled trial with three parallel groups depending on hemostatic agents used. Endodontic microsurgery procedures were performed in adherence to the Yonsei protocol described in a previous study and operated by three operators. Hemorrhage control was evaluated as adequate or inadequate by the operator and two independent examiners. The participants were scheduled for recall visits at 6 and 12 months and the outcomes were assessed based on radiographic and clinical measures at 12-month follow-up. Cell viability of HOBs cultured in Expasyl or Traxodent significantly decreased with a time interval from 2 minutes to 1 hour. The expression of TGF-B significantly decreased and the expression of IL-8 significantly increased in the Expasyl group only. Both RUNX-2 and OCN expressions were significantly reduced in the Expaysl and Traxodent group. Expasyl proved to be most efficient in bleeding control, but it also induced the most inflammation and caused delay in bone healing. Traxodent was relatively easily removed and did not interfere with bone healing; however, it did not exhibit a statistically significant hemostatic effect when compared to the control defects. In the clinical trial, 83 patients were evaluated at 12-month follow-up and the overall success rate of endodontic microsurgery was 91.6%. Statistical analysis revealed no significant difference in surgery outcome depending on the types of hemostatic agents used. The results of this study suggest that Expasyl can be used as additional hemostatic agent if adequate hemostasis is not achieved with epinephrine alone during apical surgery; however, due to its cytotoxicity and potential to cause adverse tissue reactions, Expasyl should be removed as thoroughly as possible after application. Although the main composition of Traxodent is also 15% aluminum chloride, it was not as efficient in bleeding control; therefore, Traxodent is not an appropriate substitute for Expasyl as a hemostatic agent in periapical surgery.

치근단절제술의 성공적인 결과를 위해서는 적절한 밀도의 근단부 충전이 필수적이다. 절제된 치근의 표면을 확인하고 재료를 오염없이 충전하기 위해서는 수술 부위의 효과적인 지혈이 중요하다. 본 연구의 목적은 1) 알루미늄 염화물을 함유한 지혈제인 Expasyl (Pierre Rolland, Merignac, France)과 Traxodent(Premier Dental, Plymouth, PA, USA)의 인간 조골세포(HOBs, Promocell, Hidelberg, Germany)에 대한 세포독성을 평가하고, 2) 토끼 두개골의 표준화된 골 결손부에서 이들의 지혈 효과와 조직 반응을 조사하며, 3) 무작위 배정 연구를 통해 치근단 수술의 결과에 미치는 영향을 평가하는 것이다. 세포 실험에서는 고농도 및 저농도의 재료 추출 배지에서 배양된 HOB 의 세포 생존율을 Cell Counting Kit-8 (CCK 8) 로 측정하였다. 골형성 특이 유전자인 알칼리인산분해효소 (ALP), 오스테오칼신 (OCN), Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) 와 염증 특이 유전자인 인터루킨 ((IL)-6, IL-8, 그리고 형질전환 성장인자(TGF)-β의 발현 수준을 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 분석하였다. 동물 실험에서는 6마리의 뉴질랜드 토끼의 두개골에 6개의 표준화된 골 결손 (직경 5mm, 깊이 1.5mm)을 형성하고, 각 결손부는 다음 6개 그룹 중 하나에 무작위로 배정되었다: 대조군, 에피네프린, Expasyl 적용 후 소파술과 생리식염수 세척을 시행한 그룹, Expasyl 적용 후 생리식염수로만 세척한 그룹, Traxodent 적용 후 소파술과 생리식염수 세척을 시행한 그룹, Traxodent적용 후 생리식염수로만 세척한 그룹. 모든 지혈제는 2분간 적용 후 속해있는 그룹에 따라 해당되는 방법으로 제거되었다. 지혈제 적용 전후의 출혈량은 수술 중 촬영된 사진을 바탕으로 3명의 검사자가 평가하고 점수화 하였으며, 지혈 효과는 초기와 최종 출혈 점수의 평균 차이로 결정되었다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색과 마손 삼색 염색 두 가지 방법을 사용하여 분석한 조직 표본을 통해 사용된 지혈제와 관련된 조직 반응과 골 재생을 평가하였다. 임상 연구는 사용된 지혈제에 따라 세 개의 평행 그룹으로 구성된 무작위 대조 시험으로 구성되었다. 미세치근단 수술 절차는 이전 연구에서 보고된 연세 프로토콜에 따라 세 명의 술자에 의해 진행되었다. 사용된 지혈제의 지혈 효과는 술자와 두 명의 독립적인 검사자에 의해 적절 또는 부적절로 평가되었다. 환자들은 수술 후 6개월과 12개월에 내원하여 방사선 및 임상적 검사 결과를 기반으로 평가되었다. 세포 실험 결과 Expasyl 또는 Traxodent 에서 배양된 HOB 의 세포 생존율은 2분, 10분, 1시간으로 갈수록 유의하게 감소하였다. Expasyl 그룹에서만 TGF-B 발현은 유의하게 감소했고 IL-8 발현은 유의하게 증가하였다. RUNX-2 와 OCN 발현은 Expasyl 과 Traxodent 그룹 모두에서 유의하게 감소하였다. 동물 실험 결과 Expasyl 은 출혈 조절에 가장 효과적이었지만, 가장 많은 염증을 유발하고 골 치유를 지연시켰다. Traxodent 는 상대적으로 쉽게 제거되고 골 치유를 방해하지 않았지만, 대조군 결손에 비해 유의한 지혈 효과를 보이지 않았다. 임상 실험에서 총 83명의 환자가 술 후 12개월에 평가되었고 미세치근단 수술의 전체 성공률은 91.6% 였다. 통계 분석 결과, 사용된 지혈제 유형에 따른 수술 결과의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 이 연구 결과는 Expasyl 이 미세치근단 수술 중 epinephrine 만으로 충분한 지혈을 얻을 수 없을 때 추가적인 지혈제로 사용될 수 있음을 시사하지만, 세포독성과 부작용을 일으킬 가능성 때문에 적용 후 가능한 철저히 제거해야 함을 나타낸다. Traxodent 의 경우 주요 성분은 Expasyl 과 동의함에도 불구하고 지혈 효과가 충분하지 않은 것으로 나타났다.