Nanosilver fluoride-coated orthodontic elastomerics for inhibition of biofilm formation and demineralization

Abstract

In orthodontic treatment, biofilms are easily formed around orthodontic brackets and are difficult to remove, increasing the risk of dental caries. Thus, this study developed a nano silver fluoride sustained-release orthodontic elastomerics (NSF-RE), to prevent biofilm accumulation and white spot lesions (WSLs) formation around orthodontic brackets, and assessed its chemical and physical properties, along with its anti-biofilm and demineralization-inhibiting effect for clinical applications. The first objective of this study was to identify the optimal coating solution conditions for sustained release of silver nanoparticles (AgNPs), fluoride and to evaluate its physical properties. The second objective was to assess the antimicrobial persistence and anti-biofilm effects against Streptococcus mutans (S. mutans), and the third objective was to evaluate the anti-biofilm and demineralization-inhibiting effects on a multispecies biofilm model. In the first study, orthodontic elastomerics were coated with four different combinations of ethyl cellulose and polyethylene glycol, mixed in varying compositions, using a dip-coating method. The release amount and duration of AgNPs and fluoride from the coated elastomerics, along with the compatibility of the tensile force with orthodontic brackets, was evaluated. Elastomerics coated with solutions containing ethyl cellulose demonstrated sustained release of both AgNPs and fluoride for 7 days. Cumulative release for 7 days showed that elastomerics coated with a 2:1 ratio of ethyl cellulose to polyethylene glycol (NSF-EP2) exhibited significantly higher cumulative release compared to other groups (P < 0.01). Tensile forces were not significantly different among groups. The second study evaluated the antimicrobial persistence and anti-biofilm effects of the coated elastomerics against S. mutans. The antibacterial effect was assessed by placing the elastomerics on S. mutans-inoculated agar plates, incubating for 24 h, and then transferring the elastomerics to fresh agar plates daily for 7 days. The inhibition zone was measured. The anti-biofilm effect was evaluated by quantifying the colony forming units (CFUs) and analyzing the biofilm thickness and live/dead cell ratio using confocal laser scanning microscopy (CLSM) after 64 h of biofilm maturation. NSF-EP2 showed the largest inhibition zone, significantly larger than NSF and NSF-E by 2.64 and 1.31 times, respectively (P < 0.001 and P < 0.001, respectively). NSF-EP2 also had 57% lower CFUs compared to the control (P < 0.001). CLSM results indicated that NSF-EP2 significantly reduced biofilm thickness by 83% and live/dead cell ratio by 96% compared to the control (P < 0.001), showing the highest anti-biofilm effect among the groups. The third study assessed the anti-biofilm and demineralization-inhibiting effects of NSF-RE using a multi-species dental biofilm model. Biofilm was formed on bovine enamel specimens, and biofilm maturity was evaluated daily for 7 days using quantitative light-induced fluorescence (QLF) to measure the red/green ratio (R/G ratio). After 7 days of biofilm formation, cell viability was assessed using CFUs, and biofilm thickness and live/dead cell ratio were evaluated using CLSM. Microbial composition changes were analyzed on days 3 and 7 using next-generation sequencing (NGS). Demineralization inhibition was evaluated by measuring mineral loss (ΔF, ΔFmax) in enamel beneath the biofilm using QLF. The effective range of released substances from the elastomerics was assessed by measuring enamel ΔΔF at varying distances from the elastomerics. NSF-EP showed a significantly lower R/G ratio than the control from day 3 (P = 0.013). CFUs analysis showed a 9.4% reduction in total bacteria and a 13.0% reduction in aciduric bacteria compared to the control (P = 0.001 and P = 0.04, respectively). CLSM results showed a 36.1% reduction in biofilm thickness (P = 0.036), with no significant difference in live/dead cell ratio. The sum of relative abundance of five bacteria associated with dental caries (S. mutans, L. fermentum, V. dispar, V. atypica, V. parvula) was lowest in NSF-EP. NSF-EP significantly increased ΔF and ΔFmax by 34.8% and 38.7%, respectively, compared to the control (P < 0.001 and P = 0.001, respectively). There was no significant difference in ΔΔF at different distances from the elastomerics. NSF-EP, which had the highest cumulative release of AgNPs and fluoride, showed the greatest anti-biofilm and demineralization-inhibiting effects in all evaluations. In conclusion, NSF-RE containing ethyl cellulose demonstrated anti-biofilm and demineralization-inhiniting effects by continuously releasing AgNPs and fluoride for 7 days, indicating its potential effectiveness in preventing WSLs formation during orthodontic treatment.

교정치료 중 브라켓 주변은 바이오필름의 침착이 쉽고, 제거가 어려워서 치아우식증이 호발하는 위험 부위이다. 따라서 본 연구에서는 해당 부위의 바이오필름 침착과 백색 병소의 예방을 위해 나노불화은이 서방형으로 용출되는 교정용 탄성체(Nano silver fluoride sustained-release orthodontic elastomerics; NSF-RE)를 개발하고, 화학적 및 물리적 특성을 확인하였다. 또한 항바이오필름 및 탈회 억제 효과를 평가하여 임상적 활용가능성을 확인하였다. 첫 번째 연구의 목적은 나노불화은을 서방용출하는 최적의 코팅용액 조건을 탐색하고, 코팅용액이 적용된 탄성체의 물리적 특성을 평가하는 것이었다. 두 번째 연구의 목적은 S. mutans에 대한 항균 지속 및 항바이오필름 효과를 평가하는 것이었고, 세 번째 연구의 목적은 다균종 바이오필름에 대한 항바이오필름 및 탈회 억제 효과를 평가하는 것이었다. 첫 번째 연구에서 에틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜을 각각 다른 조성으로 혼합한 4가지 조합의 용액에 딥 코팅 방법으로 교정용 탄성체를 코팅하였다. 제작된 탄성체에 대해 은 나노입자(AgNPs)와 불소의 용출량 및 용출 기간을 평가하였다. 또한 항균 코팅이 탄성체의 인장력에 미치는 영향을 평가하였다. 코팅용액에 에틸셀룰로오스가 포함된 경우, 탄성체 표면으로부터 AgNPs와 불소 모두 7일 동안 지속적으로 용출되었다. 누적 용출량 평가 결과, 에틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜이 2:1의 비율로 구성된 코팅용액을 적용한 탄성체(NSF-EP2)는 다른 조성의 코팅용액이 적용된 탄성체에 비해 유의하게 많은 은 나노입자와 불소 누적 용출량을 보였다(P < 0.01). 한편 코팅 유무 및 코팅용액의 종류에 따른 탄성체 간의 인장력은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 두 번째 연구에서는 S. mutans에 대한 코팅 탄성체의 항균 지속 및 바이오필름 형성 억제 효과를 평가하였다. 항균 지속 효과는 S. mutans를 도말한 고체 배지 표면에 탄성체를 올려놓고 24시간 배양한 후, S. mutans가 도말된 새로운 고체 배지로 탄성체를 옮겼다. 동일한 과정일 7일 동안 반복하고, 7일 후 배지 표면에 형성된 inhibition zone을 mm단위로 측정하였다. 바이오필름 형성 억제 효과는 시편 표면에서 64시간 성숙된 S. mutans 바이오필름에 대해 colony forming units (CFUs)를 확인하였고, confocal laser scanning microscope (CLSM)을 이용하여 바이오필름의 두께와 live/dead cell ratio를 평가하였다. 그 결과, NSF-EP2는 가장 큰 inhibition zone을 보였으며, NSF 및 NSF-E에 비해 각각 2.64배, 1.31배 유의하게 컸다(각각, P < 0.001, P < 0.001). 바이오필름 평가에서도 NSF-EP2의 CFUs는 control에 비해 57% 유의하게 낮았다(P < 0.001). CLSM 결과, NSF-EP2는 control에 비해 바이오필름의 두께는 83%, live/dead cell ratio는 96% 유의하게 감소하였다(P < 0.001). NSF-EP2의 항바이오필름 효과는 다른 군에 비해 가장 높았다. 세 번째 연구에서는 다균종 dental 바이오필름 모델인 dental microcosm biofilm model을 이용하여 NSF-RE의 항바이오필름 및 탈회 억제 효과를 평가하였다. 우치 시편 표면에 바이오필름을 형성시키고, 1일 간격으로 총 7일 동안 QLF를 이용한 바이오필름의 성숙도(Red/Green ratio; R/G ratio)를 평가하였다. 바이오필름 형성 7일 후 CFUs를 이용하여 cell viability를, CLSM을 이용하여 바이오필름의 두께와 live/dead cell ratio를 평가하였다. 바이오필름 형성 3일, 7일차에 NGS를 이용한 미생물 조성의 변화를 평가하였다. 탈회 억제 효과는 7일 동안 성숙된 바이오필름 하방의 법랑질에 QLF를 적용하여 mineral loss (ΔF, ΔFmax)를 평가하였다. 탄성체로부터 용출되는 유효물질의 작용 거리는 시편에 부착된 탄성체로부터의 거리에 따른 법랑질의 ΔΔF로 평가하였다. 평가 결과, 에틸셀룰로오스와 폴리에틸렌글리콜이 2:1로 구성된 코팅용액을 적용한 탄성체(NSF-EP)의 R/G ratio는 control에 비해 3일차부터 유의하게 낮은 값을 보였다(P = 0.013). Cell viability 평가 결과, CFUs는 control에 비해 total bacteria에서 9.4%, aciduric bacteria에서 13.0% 유의하게 감소하였다(각각, P = 0.001, P = 0.03). CLSM 평가 결과, 바이오필름의 두께는 36.1% 유의하게 낮았으나(P = 0.036) live/dead cell ratio는 유의한 차이를 보이지 않았다. 바이오필름 성숙 3일, 7일 차에 치아우식과 관련 있는 것으로 알려진 5 종의 박테리아(S. mutans, L. fermentum, V. dispar, V. atypica, V. parvula)에 대한 상대풍부도의 총합은 NSF-EP에서 가장 낮았다. NSF-EP의 ΔF와 ΔFmax는 control과 비교하여 각각 34.8%, 38.7% 유의하게 높았다(각각, P < 0.001, P = 0.001). 시편 내 탄성체로부터 거리에 따른 ΔΔF는 유의한 차이를 보이지 않았다. AgNPs와 불소의 누적용출이 가장 많았던 NSF-EP는 모든 평가항목에서 가장 항바이오필름 및 탈회 억제 효과를 보였다. 결론적으로, 본 연구는 나노불화은으로 코팅된 새로운 교정용 탄성체가 AgNPs 및 불소를 7일 동안 지속적으로 용출함으로써 다균종 바이오필름 형성 및 백색 병소 예방에 유의미한 효과를 제공할 수 있음을 확인하였다.