Role of Notum in Cusp and Root Patterning of Mouse Molars

Abstract

Notum has been identified as a direct target of the Wnt/β-catenin signaling pathway and serves a crucial function as a Wnt inhibitor within the negative feedback loop. In the tooth, Notum expression is evident in odontoblast progenitors and early odontoblasts during root formation. Moreover, Notum-deficient mice exhibit severe dentin defects and irregular roots in their teeth. However, the expression pattern of Notum during early tooth development and its role in crown and root patterns remains elusive. In the present study, the expression pattern of Notum and other tooth-specific genes was investigated with RNA in-situ hybridization and single-cell RNA sequencing analysis. The effect of Notum on crown and root patterning was investigated using Notum knockout mice by examining the phenotypic changes with microscopic and micro-CT techniques. Additionally, total RNA sequencing analysis in developing tooth germs was utilized to study the molecular changes in Notum-deficient mice. Notum was expressed in the primary enamel knot (EK), secondary EKs, and dental papilla during tooth development. Notum-deficient mice exhibited enlarged secondary EKs, resulting in broader cusp tips, altered cusp patterns, and reduced concavity in crown outline. These changes in crown outline are directed to diminished cervical tongue length, which induces root fusion in the Notum-deficient mice. Moreover, at the molecular level, Fgf20, Dkk4, and Fgf4, which are the Wnt target genes expressed in the secondary enamel knots, were significantly upregulated in E16.5 Notum- deficient molars. These findings support the previous concept that the tooth cusp and crown pattern considerably influence the root pattern. The size of the secondary enamel knot, regulated by the Wnt/Notum negative feedback loop, significantly impacts the patterns of the crown and root during tooth morphogenesis.

Notum 은 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 직접적인 표적이면서 동시에 Wnt 억제제로서의 역할도 하므로, Wnt/Notum 음성되먹임 기전이 알려져있다. 지금까 지 치아 영역에서는, 치아뿌리형성 중 상아질모세포 전구체와 초기 상아질모세포 에서 Notum 이 발현된다는 것과 Notum-결손 시 상아질에 결함이 생기고 치아뿌 리의 형태가 변형된다는 사실이 보고되었다. 하지만, 치아발생 초기 치아머리에서 Notum 의 발현 패턴과 치아머리 형태형성 과정 중 Notum 역할은 여전히 불분명 하다. 본 연구에서는 RNA in situ hybridization 와 단일 세포 RNA-sequencing 분석 을 통해 치아발생 초기단계에서 Notum 의 발현 패턴을 조사하였고, Notum 유전 자 결손 마우스의 치아를 전자현미경 및 마이크로-CT 기법으로 관찰함으로써, 교두와 치아머리, 치아뿌리 패턴형성 과정에서 Notum 의 역할을 확인하였다. 또한, 발생중인 치배에서 추출한 RNA-sequencing 분석을 통해 Notum 결손으로 야기 되는 분자적 변화를 조사하였다. 결과로서, 치아발생동안 Notum 은 1 차 법랑질결절, 2 차 법랑질결절 및 치아유 두에서 강하게 발현되었다. Notum-결손 마우스의 어금니에서 2 차 법랑질결절이 커지고, 교두 끝이 뭉툭해지고, 교두의 배열이 달라지며, 치아머리 윤곽의 굴곡이 감소한 것을 확인했다. 이러한 치아머리 윤곽의 변화에 이어 치아목 부분에서 혀 모양 상피의 길이가 짧아지고, 치아뿌리들이 융합되었다. 이처럼 발생단계에 따른 순차적인 변화는 교두의 패턴이 치아머리와 치아뿌리 패턴을 조절한다는 이전의 개념과 일치한다. 또한, Notum-결손 마우스의 어금니에서, 2 차 법랑질결절에서 발현되면서 Wnt 표적 유전자이기도 한 Fgf20, Dkk4 와 Fgf4 유전자의 발현량이 유의하게 증가된 것을 분자 수준에서 확인하였다. 이상의 결과를 바탕으로, Wnt/Notum 음성 되먹임 기전이 2 차 법랑질결절의 크 기를 조절함으로써 치아머리와 치아뿌리의 패턴형성을 조절한다는 것을 제안한다.