In vivo tracking of transfused platelets to measure platelet survival by NGS method using mitochondrial DNA

Abstract

Introduction: The measurement of recovery and survival of platelets is an important decisive factor when ‘new’ platelet products have been developed. Mitochondrial DNA (mtDNA) markers have been identified as potential targets for the quantitication of endogeneous and allogeneic platelets in the blood of individuals who received platelet transfusions. This study endeavors to achieve whole mitochondrial genome sequencing via next-generation sequencing (NGS) to detect polymorphisms capable of effectively distinguishing between endogenous platelets and transfused counterparts. By leveraging NGS-based techniques, we aim to evaluate a comprehensive and practical approach for assessing platelet transfusion outcomes. Materials and methods: A total of 30 whole blood samples were collected from nine patients who had recently undergone single donor platelet apheresis, with no recent history of platelet transfusion. A series of in vitro platelet mixing experiments were conducted using ABO-identical platelet concentrates, with varying ratios (1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 and 1:100) of mixed platelet suspensions. Mt DNA was extracted from platelet components and peripheral blood, followed by library construction and sequencing using the Novaseq platform. Bioinformatic analysis involved sequence alignment, variant calling, and selection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for analysis. SNPs specific to transfused platelets were identified by comparing pre- and post-transfusion sequence data, enabling platelet quantification. Results and discussions: Fourteen platelet suspensions were used to create seven pairs. Each pair combined two suspensions in dilution ratios from 1:1 to 1:100. About 33 SNPs on average were identified as markers for each mixture. Analysis showed strong linear correlation (R2-value ≥ 0.970) between expected and observed ratios for dilutions 1:1 to 1:100, with slopes near 1.0 and intercepts close to 0.0. In patient 1 to 7, one unit of apheresis platelet product was transfused in each patient. A total of 33, 32, 15, 46, 39, 7 and 23 SNP markers were selected to diffrentiate between the patient’s and transfused platelets, respectively. Based on the average frequency of selected SNP markers and the total platelet count in 14 blood samples, it was possible to estimate the patient's platelet count and the transfused platelet count in each specimen. In patient 8 and 9, 4 and 5 units of apheresis platelet products were transfused, respectively. A total of 50 (14 for first, 9 for second, 16 for third and 11 for fourth transfusion) and 49 (11 for first, 5 for second, 18 for third, 3 for fourth and 12 for fifth transfusion) SNP markers were selected. Based on the average frequency of selected SNP markers and the total platelet count in 16 blood samples, it was possible to calculate the patient's platelet count and the transfused platelet count from all apheresis platelet products in each specimen. Conclusion: In this study, we have evaluated an NGS method for sequencing the whole mitochondrial genome. This method has been employed to detect polymorphisms that enable the differentiation between endogenous platelets and transfused platelets. Our findings demonstrate the utility of this method as a valuable tool for assessing platelet survival from apheresis platelet products within patients. In cases where the platelet count does not increase as anticipated following platelet transfusion in patients with thrombocytopenia, this method is expected to helpful that discerning whether the cause originates from the patient or from the transfused platelets would be beneficial. 서론: 혈소판 회복 및 생존율 측정은 '새로운' 혈소판 제제가 개발될 때 중요한 결정적인 요소다. 수혈을 받은 환자의 혈액 내에서 환자의 혈소판 및 수혈된 혈소판을 정량화하기 위해 미토콘드리아 DNA 표지자들의 가능성이 알려져 왔다. 본 연구는 차세대 염기서열 분석법을 통해 전체 미토콘드리아 유전체의 염기서열분석을 시도하여 환자의 혈소판과 수혈된 혈소판을 효과적으로 구별할 수 있는 단일염기다형성을 검출하고자 한다. 차세대 염기서열 분석법을 기반으로 한 검사법을 활용하여 혈소판 수혈 결과를 평가하기 위한 포괄적이고 실용적인 접근 방법을 평가하고자 하였다. 재료 및 방법: 혈소판 수혈 이력이 없는 9명의 환자로부터 총 30개의 전체 혈액 검체를 수집하였다. 먼저, 두 개의 ABO 동형 혈소판 농축액을 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 및 1:100의 다양한 비율로 혼합하여 시험관 내 혼합실험을 수행하였다. 혈소판 성분과 말초 혈액으로부터 미토콘드리아 DNA를 추출한 후 Novaseq 플랫폼을 사용하여 염기서열 라이브러리를 구축하고 염기서열을 분석하였다. 생물정보학적 분석은 서열 정렬, 변이 호출 및 분석을 위한 단일 염기다형성 선택을 포함하여 수행되었다. 수혈 전과 후의 염기서열 분석 결과를 비교하여 수혈된 혈소판을 특정할 수 있는 단일염기다형성을 확인함으로써 검체 내 수혈된 혈소판을 정량화하였다. 결과 및 고찰: 14개의 혈소판 농축액을 통해, 총 7쌍의 혈소판 혼합물을 실험에 이용하였다. 각 혈소판 혼합물은 1:1부터 1:100의 희석 비율로 희석되었다. 평균적으로 33개의 단일염기다형성들이 각 혼합물에 대한 표지자로 선택되었다. 분석 결과, 1:1에서 1:100의 희석 비율에 대한 예상 및 관측된 비율 사이에 강력한 선형 상관관계 (R2-값 ≥ 0.970), 기울기가 1.0 근처에 있고 절편이 0.0 근처에 있는 것을 확인하였다. 환자 1에서 7까지, 각 환자에게 성분채혈혈소판제제 1 단위가 수혈되었다. 환자의 혈소판과 수혈된 혈소판을 구별하기 위해 총 33, 32, 15, 46, 39, 7 및 23개의 단일염기다형성 표지자들이 선택되었다. 14개의 혈액 검체에서 선택된 단일염기다형성 표지자들의 평균 빈도와 총 혈소판 수를 기반으로 각 검체에서 환자의 혈소판 수와 수혈된 혈소판 수를 계산할 수 있었다. 환자 8과 9에서 각각 성분채혈혈소판제제 4단위와 5단위가 수혈되었다. 총 50개 (첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 수혈에 각각 14, 9, 16, 11개) 및 49개 (첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 수혈에 각각 11, 5, 18, 3, 12개)의 단일염기다형성 표지자들이 선택되었다. 16개의 혈액 검체에서 선택된 단일염기다형성 표지자들의 평균 빈도와 총 혈소판 수를 기반으로 모든 성분채혈혈소판제제에서 유래된 수혈된 혈소판 수와 환자의 혈소판 수를 계산할 수 있었다. 결론: 본 연구에서는 전체 미토콘드리아 유전체를 염기서열 분석하기 위한 차세대 염기서열 분석법을 평가하였다. 이 검사법은 환자의 혈소판과 수혈된 혈소판을 구별할 수 있었고, 환자 내 혈소판 제제에서 유래된 혈소판의 생존을 평가하는 데 유용한 도구로서의 가치를 확인하였다. 이 검사법은 혈소판감소증 환자에서 혈소판 수혈 후에 기대한 대로 혈소판 수가 증가하지 않는 경우, 환자 자체에서 비롯된 원인인지 수혈된 혈소판에서 비롯된 원인인지를 구별하는 데 도움이 될 것으로 기대된다.