Effect of Particulate Matter Exposure on Endometriosis Associated Signaling Pathways and Disease Progression

Abstract

Endometriosis is an estrogen-dependent gynecological disease in which endometrial cells attaches to and grows in tissues other than the uterus, such as the ovaries, fallopian tubes, and other pelvic organs. The disease causes painful symptoms such as severe pelvic pain, dysmenorrhea and dyspareunia, but is also associated with female infertility. Although relatively common, the exact pathogenesis of this disease is not clearly understood, yet. Numerous gynecological diseases are believed to be caused by a combination of genetic, hormonal, and environmental factors, with air pollution being one of the most significant. Particulate matter(PM) negatively affects almost every tissue in the body and is a serious health concern worldwide because of its detrimental effects on our health. PM has been linked to altered estrogen metabolism by increasing chronic inflammation, oxidative stress, and endocrine disruption. Since, estrogen plays an important role in the growth and development of endometrial tissue, estrogen imbalances caused by PM may promote the proliferation of endometriosis lesions and worsen symptoms of endometriosis. Although some studies have reported effects of PM exposure on the female reproductive system, the exact mechanisms underpinning the negative effects of PM on endometriosis are not fully elucidated yet. In this study, we hypothesized that repetitive exposure of PM induces alteration of signaling pathways that are known to be associated with endometriosis and promotes progression of the disease. Endometrial tissue without endometriosis was collected and cultured with primary cells. Then, while the endometrial cells were subcultured, PM was repeatedly exposed for 24 hours, and the result was observed using molecular biology technology. Through Z-stack imaging, PM entering the cells were observed and identified. As a result of CCK8, wound healing, and FACS analysis, it was found that repeated PM exposure during subculture induces cell proliferation and reduces apoptosis of endometrial cells. Examination of protein expression revealed that proliferation was induced through p-ERK signaling and apoptosis was reduced through p-p53. Also, the expression of p-p53 fluorescent staining was significantly reduced. qRT-PCR confirmed the reduction of apoptosis through Bax/Bcl-2 and Cas3 and the increase of oxidant stress through the Nrf2 mechanism. Endometriosis mouse model was utilized using autologous surgical engraftment of uterine tissue in peritoneal cavity. Exposure to PM for 4 weeks significantly increased lesions size with significantly increased inflammatory process, increased proliferation and migration, and decreased apoptosis in endometriotic lesions. PM also induced altered expression of ER-α/ER-β, which also contribute to the growth and proliferation of endometrial lesions. The results indicate that PM induced alterations of several signaling pathways that are associated with endometriosis and progression of the disease. In conclusions, this study, for the first time, revealed possible association of PM exposure and endometriosis using in vitro and in vivo model. 자궁내막증은 자궁내막 조직이 난소, 나팔관 및 기타 골반 기관과 같은 자궁 이외의 조직에 부착하여 증식하는 에스트로겐 의존성 부인과 질환이다. 이 질환은 심한 골반통증, 월경통, 성교통과 같은 고통스러운 증상을 유발하고 여성 불임과도 관련이 있다. 비교적 흔하지만 이 질병의 정확한 발병 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 수많은 부인과 질환은 유전적, 호르몬적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있으며, 대기 오염이 가장 큰 원인 중 하나로 지목되고 있다. 미세먼지는 우리 몸의 거의 모든 조직에 부정적인 영향을 미치며, 건강에 해로운 영향을 미치기 때문에 전 세계적으로 심각한 건강 문제로 대두되고 있다. 미세먼지는 만성 염증, 산화 스트레스 및 내분비 교란을 증가시켜 에스트로겐 대사를 변화시키는 것과 관련이 있다. 에스트로겐은 자궁내막 조직의 성장과 발달에 중요한 역할을 하므로, 미세먼지로 인한 에스트로겐 불균형은 자궁내막증 병변의 증식을 촉진하고 자궁내막증 증상을 악화시킬 수 있다. 일부 연구에서 미세먼지 노출이 여성 생식기관에 미치는 영향이 보고되었지만. 미세먼지가 자궁내막증에 미치는부정적인 영향을 뒷받침하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 미세먼지의 반복적인 노출이 자궁내막증과 관련이 있는 것으로 알려진 신호 전달 경로의 변화를 유도하고 질병의 진행을 가속화한다는 가설을 세웠다. 자궁내막증이 없는 자궁내막 조직을 수집하고 일차세포로 배양했다. 그런 다음 미세먼지를 24시간 반복 노출하면서 계대배양을 진행한 자궁내막 세포를 분자생물학전인 기법을 통해 결과를 관찰하였다. Z-stack을 통해 미세먼지가 세포내에 들어간 것을 확인했다. CCK8, Wound healing과 FACS 분석 결과에서 미세먼지를 반복 노출하고 계대배양을 진행하면 세포증식을 유도하고 자궁내막 세포의 세포사멸을 감소시키는 것을 확인했다. 단백질 발현을 조사한 결과, p-ERK 신호 전달을 통해 증식이 유도되고, p-p53을 통해 세포사멸이 감소하는 것으로 나타났다. 또한, p-p53 형광 염색의 발현도 유의미하게 감소하였다. qRT–PCR을 수행하여 Bax/Bcl-2, Cas3를 통한 세포사멸 감소와 Nrf2 기전을 통한 산화 스트레스 증가를 확인했다. 복강 내 자궁 조직을 이식하는 외과적 수술을 통해 자궁내막증 마우스 모델을 만들었다. 4주 동안 자궁내막증 마우스 모델에 미세먼지를 노출하면 자궁내막증 병변의 염증 증가, 증식 및 이동 증가, 세포 사멸 감소와 함께 병변의 크기가 증가했다. 또한 미세먼지는 자궁내막 병변의 성장과 증식에 기여하는 ER-α/ER-β의 발현 변화를 유도했다. 따라서, 미세먼지는 자궁내막증과 관련된 여러 신호 전달 경로의 변화를 일으킨다. 결론적으로, 본 연구는 세포 및 마우스 모델을 통해 미세먼지 노출과 자궁내막증의 연관성을 처음으로 밝혀냈다.