Identification of Obinutuzumab-induced Lysosomal Membrane Permeabilization Modulators via CRISPRi-based Screening in B Cell Lymphoma

Abstract

Non-Hodgkin lymphoma (NHL) is a cancer of the lymphatic system that is treated by chemotherapy and CD20-based immunotherapy such as obinutuzumab (OBI). OBI is a second-generation Fc-glycoengineered type II antibody with increased interaction with FcγRⅢa which is expressed on immune effector cells. OBI differs from type I anti-CD20 antibodies in that it promotes greater antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) and direct cell death (DCD). The major phenotypes of OBI-induced DCD include homotypic adhesion and lysosomal membrane permeabilization (LMP). However, the action mechanism of OBI-induced LMP still remains unclear. Gaining further insight into OBI’s mode of action can aid in developing improved therapeutics to treat refractory and relapsed NHL. Here, we used a CRISPRi-based screening approach to identify regulators of OBI-induced LMP and cell death with two goals. The first goal was to identify genes that modulate OBI-induced lysosomal membrane permeabilization using the CRISPRi screening platform, and the second goal was to discover combination therapeutic methods that synergistically enhance OBI-induced DCD. We used a CRISPRi sub-library that targets kinases, phosphatases and drug targets and identified the 15 key negative regulators of OBI-induced LMP. We further validated candidate genes and identified PIKfyve as a key regulator of OBI-induced LMP. We found that PIKfyve inhibition by Apilimod sensitized B cells to OBI-induced LMP. Fission inhibition by Apilimod caused lysosome coalescence and subsequent vacuolization. Furthermore, Apilimod-induced fission inhibition is in line with TRPML2 inhibition by OBI, which further compounds fission inhibition and increases OBI-induced LMP and DCD. We propose that Apilimod and OBI co-treatment can effectively and synergistically eliminate B cells to treat B cell lymphoma. 비호지킨 림프종(NHL)은 림프계통의 암으로, 화학 요법 및 obinutuzumab (OBI)와 같은 CD20 기반 면역요법으로 치료됩니다. OBI는 FcγRⅢa를 발현하는 면역 효능 세포와의 상호 작용을 증가시킨 2세대 Fc 변형기술이 적용된 2형 항 CD20항체로, 높은 항체 의존 면역세포 매개 세포독성 뿐 아니라 결합 만에 의한 직접적인 세포 사멸 (DCD)을 촉진하는 특징을 갖습니다. OBI로 유발된 DCD의 주요 형질은 리소좀 막 투과성 (LMP)을 반드시 거치는 것으로 알려져 있지만 그러나 OBI로 인한 LMP의 정확한 작용 메커니즘은 아직 불분명합니다. 본 연구는 OBI로 유발된 LMP와 DCD에 대해 이해하고, OBI 기반 DCD를 향상시키기 위한 새로운 병용약물 및 병용치료의 분자 메커니즘 제안을 목표로 합니다. 본 연구에서는 OBI로 유발된 LMP의 조절인자를 발굴하기 위해 CRISPRi 기반의 스크리닝 접근법을 사용하였습니다. PIKfyve의 발현감소는 OBI로 유발된 LMP와 DCD를 유의하게 감소시켰으며, 그 억제제인 Apilimod 처리는 라이소좀 분열 (fission)을 억제하고, 세포 내 소포체증가 (vacuolization)를 유도하여 OBI에 대한 민감도를 증진하였습니다. mTOR, WIPI등의 라이소좀 분열과 관련된 다른 기전이 아닌, PIKfvye의 억제가 OBI에 의한 TRPML2의 기능 억제와 동반되었을 때 LMP와 DCD가 증가되었습니다. 본 연구가 제안한 OBI에 의한 LMP조절 기전의 규명은 Apilimod 와 OBI 병용치료법을 B 세포 림프종의 새로운 치료방법으로 제안하는 기반 지식을 제공합니다.