Differentiation of endothelial cells from FVIII gene-corrected patient-iPSCs for hemophilia A gene and cell therapy

Abstract

Hemophilia A is an inherited bleeding disorder caused by various mutations in the coagulation factor VIII (FVIII) gene located on chromosome X. FVIII is mainly produced and secreted by endothelial cells, particularly liver sinusoidal endothelial cells. Therefore, a significant challenge in using human-induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived endothelial cells as cellular therapeutics for hemophilia A is obtaining a sufficient number of qualified endothelial cells. In this study, an improved protocol to differentiate a larger number of endothelial cells from FVIII gene-corrected patient-iPSCs for hemophilia A gene and cell therapy was established by modifying a previously reported differentiation protocol. CHIR99021, which regulates GSK3 signaling, and activin A, which regulates activin signaling, were used to induce a mesodermal lineage from human iPSCs. Then, the mesodermal lineage was further differentiated into vascular progenitors. The improved protocol resulted in a 6-fold increase in total vascular progenitor cells and a 4.6-fold increase in the proportion of VEGFR2+ vascular progenitor cells compared to the original protocol. Using magnetic-activated cell sorting (MACS), differentiated vascular progenitor cells were enriched for VE-Cad. The isolated VE-Cad+ vascular progenitor cells, when matured into endothelial cells, showed a 3-fold increase in CD31+ endothelial cells compared to previous differentiation methods. In addition, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) data showed that these cells secreted 3.4-fold higher levels of FVIII compared to the original protocol. Taken together, this study provides an improved protocol for differentiating large quantities of endothelial cells with enhanced functionality compared to previously reported methods. This advancement may improve the production of cell therapeutics for diseases that require endothelial cells, such as hemophilia. A형 혈우병은 X 염색체에 존재하는 혈액응고인자 8번 (FVIII) 유전자의 다양한 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 출혈 질환이다. FVIII은 주로 혈관내피세포, 특히 간 정현파 내피세포에서 생성 및 분비되기 때문에 A형 혈우병의 세포치료제를 위해서는 많은 수의 검증된 혈관내피세포가 필요하며, 이것은 인간 유도만능줄기세포 유래 혈관내피세포를 세포치료제로 사용하기 위해 극복해야 할 과제 중 하나이다. 따라서 본 연구에서는 기존에 보고된 혈관내피세포 분화 프로토콜을 개량하여 혈액응고인자 8번 유전자가 교정된 유도만능줄기세포로부터 더 많은 수의 기능적인 혈관내피세포를 얻기에 적합한 혈관내피세포 분화 프로토콜을 확립하였다. 분화 프로토콜을 개량하기 위해 GSK3 신호전달을 조절하는 CHIR99021과 Activin 신호전달을 조절하는 Activin A를 추가로 사용하여 인간 유도만능줄기세포를 중배엽 계통으로 분화시킨 후 혈관전구세포를 거쳐 혈관내피세포로 분화시켰다. 인간 유도만능줄기세포로부터 혈관전구세포 분화 프로토콜을 개선한 결과, 기존 프로토콜에 비해 전체 혈관전구세포의 수는 6배, VEGFR2를 발현하는 혈관전구세포의 비율은 3배 증가하는 결과를 보여주었다. 분화된 혈관전구세포는 마커 중 하나인 VE-Cad를 이용하여 자기 활성화 분류 (MACS)를 거쳐 분리되었다. 분리된 VE-Cad 양성 혈관전구세포 로부터 분화한 혈관내피세포는 여러가지 혈관내피세포 마커를 발현 하였으며, 이전 분화 방법에 비해 CD31 양성 혈관내피세포의 수가 3배 증가했다. 또한, 개선된 분화법으로 유도된 혈관내피세포의 기능을 확인하기 위해 FVIII 단백질 분비 정도를 확인한 결과, 배양액 내 FVIII 단백질 분비가 기존 분화법 대비 1.4배 증가하는 결과를 보여주었다. 이를 종합하면, 본 연구에서는 기존에 보고된 분화 프로토콜에 비해 기능이 강화된 혈관내피세포를 대량으로 생산할 수 있는 혈관내피세포 분화 프로토콜을 확립하였고, 이는 A형 혈우병의 유전자 및 세포치료제와 같이 혈관내피세포가 필요한 질환에 대한 세포의 생산성을 높이는 데 기여할 수 있을 것으로 생각된다.