Designing anti-HER2 multi-paratopic nanobody for bending-induced inactivation

Abstract

Trastuzumab is a monoclonal antibody that targets HER2 receptors and is effectively used to inhibit cell growth and induce cell death. In addition, T-DM1, antibody-drug binding (ADC) of trastuzumab, effectively delivers drugs into cells by endocytosis then induces apoptosis. However, this effect can be limited in cancer cells with low HER2 expression. In a recent study, it was reported that the domain II portion of HER2 plays a role in inhibiting heterodimeric intracellular influx. In this study, we discovered nanobodies that bind to multiple domains of HER2 and designed multiple paratope nanobodies that not only have improved binding power but also induce inactivation through structural changes in HER2 domain II. After discovering multiple nanobodies through screening of a synthetic nanobody library with 1012 diversity, we predicted the sites that bind to HER2 by in-silico method and identified that they bind to actual fragmented HER2 proteins by biochemical methods to select nanobodies that bind to different domains I, II, and III. Among the multi- bond forms configured with the three nanobodies, we observed that the configuration with a short, flexible linker in the binding order of domain I, III, and II was effective. In their Fc forms, the order of I, II, and III with higher binding affinity than I, III, and II orders demonstrated effectiveness. In conclusion, this study provides a novel inactivation strategy for HER2 by inducing structural changes in HER2 itself, as well as increasing binding affinity for HER2 in malignant tumors such as gastric cancer. 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2 수용체를 특이적으로 표적하는 단일 클론 항체로, 세포 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 데 효과적으로 사용되고 있습니다. 더불어, 트라스투주맙을 이용한 T-DM1은 약물을 세포 내로 효과적으로 전달하면서 세포 사멸을 촉진합니다. 그러나 HER2 발현이 낮은 암 세포에서는 이 효과가 제한될 수 있습니다. 최근 연구에서는 HER2의 도메인 II 부분이 이종이량체 (Heterodimer) 세포 내 유입을 억제하는 역할을 한다고 보고되었습니다. 본 연구에서는 HER2의 여러 도메인과 결합하는 나노 바디들을 발굴하여 향상된 결합력을 가질 뿐 아니라 HER2 도메인 II의 구조적 변화를 통해 불활성화를 유도하는 다중 파라토프 나노바디를 설계했습니다. 1012 다양성을 가진 합성 나노바디 라이브러리의 스크리닝을 통해 여러 개의 나노바디를 발견한 후 in silico방법으로 HER2에 결합하는 부위를 예측하고, 실제 조각난 HER2단백에 결합함을 생화학적인 방법으로 확인하여 각기 다른 도메인 I, II, 및 III 부위에 결합하는 나노바디들을 선정하였습니다. 3개를 다른 순서로 연결한 다중결합 형태 중, I, III, II 순서로 짧은 유연링커로 붙은 형태가 효과가 있었고 이들의 Fc 형태에서는 I, III, II순서보다 결합력이 높은 I, II, III 순서가 효과가 있음을 확인하였습니다. 결론적으로 본 연구는 위암과 같은 악성 종양에서 HER2에 대한 결합친화도를 증가하는 것뿐 아니라 HER2 자체의 구조적인 변화를 유도하여 HER2에 대한 새로운 불활성화 전략을 제공합니다.