Biological Evaluation and Mechanism studies of Novel MK2-RIPK1 Dual Degraders

Abstract

Kinase is an important enzyme that plays a key role in multiple cell signaling pathways and regulates various cellular functions, such as the cell cycle, proliferation, growth, differentiation, metabolism, and inflammation. Kinase dysfunction is implicated in several human diseases, including oncological, immune, and neurological conditions. Because of these reasons, many drugs that inhibit kinases have been developed. But these kinds of drugs still have several issues for development, including drug resistance, low selectivity, and undruggable targets. Recently, a new approach called Proteolysis-Targeting Chimera (PROTAC) has emerged. This technology can address the limitations of current inhibitors. It consists of three components: a protein of interest, a recognizing E3 ligase, and a linker. With these structural features, PROTAC utilizes a targeted protein degradation (TPD) technology that leverages the intracellular ubiquitin proteasome system (UPS). With this approach, our previous research thoroughly analyzed the chemo-proteomics profiling of degraders based on GNF-7. Through previous research, we have found that VHL-PROTAC, with GNF-7 as a warhead, has the ability to selectively degrade MK2 and RIPK1. In this study, we designed and synthesized 16 derivatives having GNF-7 moiety as warhead. A structure activity relationship (SAR) study led to the discovery of MK2 selective degrader (30b) as chemical tool compound. 30b possessing trifluoroexthoxy pyridine warhead has excellent degradation selectivity toward MK2 (DC50 for MK2 = 0.005 ± 0.001 μM and RIPK1 = >2.5 μM). Furthermore, we revealed that 30b depleted the target kinase protein in a dose-, time-, VHL- and UPS- dependent manner by performing various biological evaluations. We also showed that 30b directly binds to p38alpha and indirectly degrades MK2. We presented a study using molecular modeling on the ternary complex model of 30b, involving the p38alpha-MK2 heterodimer and the von Hippel-Lindau (VHL) Cullin RING E3 ligase. Moreover, 30b has moderate in vivo efficacy and degrades MK2 excellently in MOLT-4 mouse xenograft model. MK2 is a crucial kinase in the inflammatory signaling pathway and tumor progression by regulating RBPs (RNA binding proteins). To date, several inhibitors targeting MK2 have been developed. Most MK2 inhibitors, except ATI450, still present hurdles in clinical development. Recently, the MK2 degradation approach has emerged as an effective strategy for inhibiting MK2, but the degrader has been poorly studied. By considering the results of this study as a whole, we gain insight into the development of a novel MK2 selective degrader, along with MK2-RIPK1 dual degraders. And this study supports further investigation of 30b as an effective treatment for inflammatory diseases and for cancer therapy.

카이네이즈는 ATP의 gamma phosphate를 기질 단백질에 전달을 촉매 하는 효소이며 세포 내 신호전달에 핵심 역할을 한다. 이러한 특징으로 다양한 세포 신호 전달을 하고 세포 주기, 증식, 생장, 분화, 대사 및 염증을 포함한 세포 기능을 조절을 한다. 따라서 암, 면역 질환과 신경 질환을 포함한 많은 인간 질병을 유발과 관련이 깊은 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 비정상적인 기능을 하는 kinase를 저해하는 저분자 화합물이 개발되어 왔다. 하지만 약물 저항성, 선택성 부여와 undruggable 카이네이즈 공략 어려움과 같은 한계점이 존재한다. 따라서 신규한 약물 개발 연구가 필요하다. 최근에는 세포 내 단백질 분해 시스템을 활용한 약물 개발 플랫폼인 표적 단백질 분해 기법이 등장했다. 프로탁은 주요 표적 단백질 분해 기법 중 하나로 E3 ligase의 리간드와 표적단백질의 리간드가 연결체를 통해 연결된 이종이기능성 화합물이다. 프로탁은 E3 ligase와 표적 단백질 간의 삼중 복합체 형성을 한다. 이후 E3 ligase에 의해 유비퀴틴화된 표적 단백질을 세포 내 분해 시스템 중 하나인 프로테아좀에 의해 분해한다. 선행연구에서 GNF-7 매개 프로탁 기반 분해제들에 대하여 global proteomics screening을 진행하였다. 이를 통해 GNF-7 매개 VHL-분해제가 CRBN-분해제 대비 MK2와 RIPK1에 대한 분해 선택성이 있음을 확인하였다. 본 학위논문에서는 선행 연구 결과를 기반으로 구조 활성 연구 와 생물학적 평가 및 분해작용기전 연구를 진행하였고, 대표 화합물인 MK2 선택적 분해제, 30b를 도출하였다. 먼저, GNF-7 골격을 보유한 16 종의 유도체에 대하여 MK2와 RIPK1에 대한 분해능 기반 구조 활성 평가를 진행하였다. GNF-7 골격에서 bulky한 잔기로 변형한 유도체들에서 MK2에 대한 분해 선택성이 우수하였다. 유도체들 중 대표 화합물 30b는 RIPK1 (DC50 = >2.5 μM) 대비 MK2 (DC50 = 0.005 ± 0.001 μM)에 대한 분해 선택성이 500 배 증가함을 보였다. 더 나아가 다양한 생물학적 평가 기법을 활용하여 30b에 대한 분해 기전을 규명하였다. 그 결과, 30b는 MK2를 VHL을 매개하여 유비퀴틴 - 프로테아좀 시스템을 통한 간접 분해제임을 보여주었다. 생물학적 방법과 분자 도킹 연구를 바탕으로 p38alpha와의 직접 결합이 MK2 분해에 영향을 미칠 가능성을 예측하였다. 마지막으로 MOLT-4 종양 마우스 모델에서 준수한 종양 형성 억제능을 관찰하였고, 세포 수준의 분해 효과와 상응하는 분해능을 보였다. 표적 단백질인 MK2는 다양한 염증 신호 전달과 종양 형성 관련 유전자 발현을 조절하는 세포 내 주요 분자로 암과 염증을 유발하는 주요 원인이다. 이에 따라 MK2를 표적하는 저해제 개발이 되어 왔다. 하지만 타겟 선택성 부여와 같은 한계점에 직면하고 있다. 이를 극복하기 위해 간접 저해와 같은 다양한 전략이 제시되어왔다. 현재까지 PROTAC 기반의 MK2 분해제는 보고된 바가 없다. 종합하여, 본 학위 논문은 MK2에 대한 분해제 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 시사한다. 또한 염증 질환과 암에 대한 적응증 확장 가능성을 보여준다.