Improvement of ischemic stroke outcome by promoting CD4+CD25+ Treg migration through CCR4 overexpression

Abstract

뇌 내의 면역세포인 미세아교세포는 허혈성 뇌졸중으로 인해 활성화한다고 알려져 있다. 미세아교세포는 허혈성 뇌졸중에서 괴사하는 뉴런과 함께 면역 반응에 관련된 인자들을 분비한다. 혈액-뇌 장벽이 파괴되면서 활성화된 전염증성 면역 세포 유입으로 인해 일어난 이차 조직 손상은 사망률과 장애 수준을 극적으로 증가시킨다. 허혈성 뇌졸중의 급성기에서 신경염증의 중요성은 집중적으로 연구되어 왔지만 급성기의 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T (Treg) 세포의 긍정적인 효과에 대해서는 아직 확실한 결과가 나오지 않았다. 하지만, 회복 단계 동안 Treg 세포의 긍정적인 효과는 신경염증을 개선하고 허혈성 뇌졸중 이후 경색 크기를 줄이는 것과 관련된다고 보고된 바 있다. Treg 세포가 이러한 신경 보호 효과를 발휘하려면 허혈성 뇌로 이동해야 하지만 Treg 이동에 관여하는 미세아교세포 유래의 인자는 아직 명확하게 정의되지 않았다. 따라서 우리는 허혈성 뇌졸중 동안 Treg 세포 이동과 관련된 특정 케모카인과 수용체 간의 상호 작용과 Treg 세포가 경색 크기 및 운동 기능에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 했다. 염증성 CD8+ T 세포와 Treg세포의 이동 패턴의 차이는 산소-포도당 결핍(OGD(+) Direct)에 노출된 1차 미세아교세포 배지와 24시간 재관류 후 수집한 배지 (OGD(+) Rep)를 사용한 trans-well 이동 분석을 통해 확인되었다. 위 조건에서 수집된 배양 배지는 활성화된 미세아교세포 유래 케모카인을 식별하기 위해 케모카인 프로파일링에 사용되었다. OGD(+) Direct 배지에서 높게 나타난 T 세포 homing 관련 케모카인에 반응하여 CD8+ T 세포와 Treg 세포 모두 OGD(+) Direct 배지로 더 많은 이동을 보여주었다. In vitro 실험을 통해 Treg 세포의 이동과 밀접하게 관련된 두 개의 후보 케모카인-수용체가 선택되었으며, Tregs를 길항제로 처리하여 trans-well 실험을 실행하였을 때, CCL22-CCR4 상호 작용의 억제가 CXCL12-CXCR4보다 OGD(+) Direct 미디어로의 이동을 크게 감소시켰다. 다음으로, Treg 세포에서 CCR4 과발현은 MSCV 레트로바이러스 (MSCV-CCR4)를 사용하여 수행되었다. MSCV-CCR4 형질도입을 하지 않은 untreated Treg 세포 (UT Treg) 과 형질도입을 한 Treg 세포 (TD Treg)를 이용해 OGD(+) Direct 배지로의 trans-well 이동 분석과 마우스에서 transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) 후 생체 내 효과를 확인했다. UT Treg과 비교하여 TD Treg에서 EGFP와 CCR4의 발현 및 OGD(+) Direct 배지로의 이동이 증가했다. tMCAO 수술 이후 TD Treg을 주입하였을 때, 경색 크기가 눈에 띄게 감소하고 운동 기능이 일부 개선된 것으로 나타났다. 결론적으로 우리는 Treg 세포의 이동에 관련된 미세아교세포 유래의 케모카인과 수용체를 발굴하였고 CCR4 발현을 늘린 Treg 세포를 주입한 tMCAO 동물 모델에서 신경 손상의 심각성을 줄임으로써 허혈성 뇌졸중에 대한 Treg세포의 신경 보호 효과를 보여주었다. The influx of activated pro-inflammatory immune cells post-ischemic stroke significantly heightens the risk of morbidity and developing disability. In response to ischemic stroke (IS), the brain microglia activate and secrete chemokines related to immune responses in the ischemic core. There are numerous studies about neuroinflammation in the initial phase of IS. During the recovery phase of IS, CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) showed positive effects by ameliorating neuroinflammation, thus reducing the infarct size post-IS. For Tregs to exert neuroprotective effects, trafficking Tregs into the ischemic brain must take place. However, the molecular mechanism of Treg migration into the brain has not yet been defined clearly. Here, we aim to investigate the specific chemokine-receptor interaction regarding the Treg migration during IS, as well as its effect on infarct size and any improvements in motor function. The differences in migratory patterns of the pro-inflammatory CD8+ T cells and Tregs were seen through trans-well migration assay in media collected from the primary microglia culture immediately after oxygen-glucose deprivation (OGD(+) Direct) and after 24-hour reperfusion (OGD(+) Rep). The conditioned microglia culture media were used in murine chemokine profiling array to identify the chemokines released by activated microglia during simulated IS conditions and during the recovery phase. Both the CD8+ T cells and Tregs showed higher migration into the OGD(+) Direct media in response to activated microglia secreting chemokines related to immune cell recruitment, especially T cell homing. From the above, two candidate chemokine-receptor pairs intimately related to Treg migration were chosen. Then, Tregs were treated with antagonists to block the potential interaction with the above two pairs where the inhibition of CCL22-CCR4 interaction showed significantly diminished migration into the OGD(+) Direct media than that of CXCL12-CXCR4. Next, CCR4 overexpression on Tregs were done using MSCV retrovirus, which were then used to see their effects in vivo after tMCAO in mice. Injection of mCcr4 transduced Tregs showed notable decreased in infarct size and some improvement in motor function in mice after 24 hours post-tMCAO. The results of current study showed the specific factors involved in Treg migration in response to microglia activation, as well as the neuroprotective effects of Tregs in reducing the severity of neuronal damage post-tMCAO in animal models.