Discovery of a Novel Therapeutic Target for Enhancing Anti-CD20 Antibody-Induced Direct Cell Death in B Cell Lymphoma Using APEX2-Based Proximity Labeling

Abstract

Non-Hodgkin's lymphoma is a clonal tumor originating from mature and immature B cells, accounting for over 500,000 annual cases worldwide. Obinutuzumab, the anti- CD20 antibody for treatment of BNHL, is recognized as biobetter of rituximab due to the enhanced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), as well as direct cell death (DCD) through antibody binding. However, the molecular biology mechanisms underlying this direct cell death induction remain poorly understood. In this study, our objective was to identify proteins that regulate cell death mediated by obinutuzumab binding to CD20. By fusing engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to the Fc terminus of obinutuzumab, we employed liquid chromatography-mass spectrometry to identify biotin-labeled proteins within a 20 nm radius of CD20 bound by obinutuzumab, comparing it to rituximab. Out of the 482 proteins, we selected protein candidates based on the genes where at least 2 peptides were detected, and the protein exhibited an intensity surpassing the value stated in the negative control. Final 14 protein candidates were based on the highest obinutuzumab/rituximab intensity ratio. To assess the impact of candidate proteins on obinutuzumab-induced lymphoma cell death and differentiate them from rituximab, we utilized shRNA-mediated knockdown cells and CRISPR-Cas9 overexpression cells. Among the candidates, MPZL1 demonstrated the most significant influence, and this effect was dependent on the quantity of MPZL1 but unrelated to phosphatase-related signal transduction. Concabody, the anti- CD20 antibody fused with the MPZL1 lignad, concanavalin, exhibited a remarkable increase in DCD for both obinutuzumab and rituximab, with this tendency was effectively recapitulated in the cell death of CD19-expressing B-lymphoma cells derived from the bone marrow in chronic lymphocytic leukemia patients. In this study, we propose MPZL1 as a protein associated with DCD through the identification of obinutuzumab binding CD20-associated proteins and suggest concabody as a biobetter of obinutuzumab based on MPZL1 dependent DCD mechanisms.

비호치킨성 림포마는 성숙 및 미성숙 B 세포의 클론성 종양으로 세계적으로 매년 50만명 이상에서 발병하는 림프종이다. 최근 개발된 항암항체인 오비누투주맙은 특징적으로 리툭시맙과 같은 type I항 CD20항체와 다르게 항체결합에 의한 직접 세포 사멸을 유도한다. 그러나 직접 세포 사멸 유도와 관련된 분자 생물학적 메커니즘은 라이소좀의 붕괘를 통한 다는 것 외에는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 오비누투쥬맙 결합 CD20주변 단백을 탐색하여 이 결합에 의한 세포사멸을 조절할 수 있는 단백을 발굴하고자 오비누투쥬맙의 Fc 부분 말단에 ascorbate peroxidase (APEX2)를 융합한 항체를 이용하여 리툭시맙과 오비누투쥬맙이 결합한 CD20의 20 nm 반경 내로 biotin 표지된 단백들을 액체 크로마토그래피-질량분석을 이용하여 동정하였다. 동정된 482가지 단백중에서 오비누투쥬맙에 더 근거리로 존재하는 후보군을 구축하기 위해 대조군 그룹과 동일하게 검출된 단백들은 제거한 후, 해당 단백절편이 2개 이상이 검출된 최종 세포막 단백질 중 Obi/Rit Intensity 비율이 높은 순으로 단백질 14개를 선정하였다. 후보유전자군들의 오비누투주맙 라이소좀 붕괘와 직접 결합에 의한 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 shRNA에 의한 발현 저하 세포와 CRISPR-Cas9 시스탬을 이용한 과발현 세포를 구축하여 관련성을 분석하였다. 그 중 MPZL1이 가장 유의한 영향을 미치는 것으로 확인되었고, 이러한 영향은 MPZL1의 양에 의존적이였으나 인산화관련 신호단전달과는 무관하였다. MPZL1 ligand로 알려진 concanavalin A를 항 CD20 항체에 결합한 형태인 concabody는 오비누투주맙뿐 아니라 리툭시맙의 직겁 결합에 의한 세포사멸을 매우 극적으로 증가시켰을 뿐 아니라 이러한 경향은 항체 의존적 세포 염증 반응에서도 증가된 효과를 보였다. 특히 Obi-ConA의 경우, CLL환자 골수에서 유래한 CD19발현 B림프암세포사멸에서도 증가된 효과를 나타내었다. 본 연구는 오비누튜주맙과 결합하는 CD20주변단백의 탐색을 통해 DCD와 관련된 기전단백으로 MPZL1을 제시할 뿐 아니라 이 기전을 이용한 concabody를 오비누투주맙의 바이오베터로 제안한다.