CDK4/6 inhibition suppresses tumor-induced angiogenesis in gastric cancer

Abstract

Tumor secretes ligands such as vascular endothelial growth factor (VEGF) for angiogenesis, which is essential for tumor growth. In previous reports, CDK4/6 has been acknowledged to regulate VEGF transcription in addition to cell cycle regulation in other cancer types such as leukemia and melanoma. However, there are few studies explaining the angiogenesis-related effects of CDK4/6 inhibitors in gastric cancer (GC). In this study, we aim to verify the anti-angiogenesis effect through CDK4/6 inhibition. First, we confirmed the proliferation and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) after CDK4/6 inhibition. CDK4/6 inhibitor, abemaciclib, inhibits 33.2% of HUVEC cell viability after treatment of 0.5 μM abemaciclib for 72h and didn’t show decrease in tube formation and migratory potential at same concentration of abemaciclib. Also, abemaciclib induced G1 arrest and cell senescence on endothelial cell. To confirm the cell senescence on endothelial cell, SA-β-gal assay was performed. The levels of SA-β-gal-positive cell staining in abemaciclib-treated group were higher than control, suggesting that abemaciclib induced cell senescence on HUVEC. Next, we studied anti-angiogenesis effect of abemaciclib in GC. To confirm changes in the amount of secreted VEGF in GC cell lines after abemaciclib treatment, secreted VEGF protein expression were measured. Additionally, it was shown that cell lines treated with abemaciclib had less secreted VEGF. We also confirmed how these reduced secreted proteins in GC cell lines affect the proliferation and tube formation of HUVEC. In HUVEC cultures supplemented with conditioned media of abemaciclib-treated GC cell lines, the proliferation of HUVEC decreased compared with those cultured in control groups in some gastric cancer cell lines. And the number of tubes were also decreased compared to control groups when using conditioned media from gastric cancer cell lines after abemaciclib treatment. In conclusion, we observed that CDK4/6 inhibition causes G1 arrest and cell senescence in HUVECs and there are VEGF down-regulation through CDK4/6 inhibition in some gastric cancer cell lines, providing a new perspective on angiogenesis for cell cycle inhibitor in GC patients. 종양은 종양 성장에 필수적인 혈관 신생을 위해 혈관내피성장인자 (VEGF)와 같은 리간드를 분비합니다. 최근 연구에서 흑색종, 백혈병 등의 암종에서 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6은 세포주기 조절 외에도 c-Jun 과 복합체를 이루어 혈관내피성장인자의 전사를 조절하는 것으로 나타났습니다. 하지만 위암에서는 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 이 혈관 신생에 미치는 영향을 설명하는 연구는 부족한 실정입니다. 본 연구에서는 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 저해에 의한 항신생혈관형성 효과를 검증하는 것을 목적으로 하고 있습니다. 첫째, 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제 후 인간제대정맥내피세포 (HUVEC)의 증식과 혈관 신생에 미치는 영향을 확인했습니다. 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제제 인 아베마시클립은 인간제대정맥내피세포 세포의 증식을 억제하지 못하고 관 형성 및 이동성 감소를 나타내지 않았습니다. 이와 달리, 아베마시클립은 G1 기 세포 주기 정지를 유발했습니다. 또한, 아베마시클립의 인간제대정맥내피세포의 노화 유발 여부를 확인하기 위해 SA-β-gal 분석을 수행했습니다. 아베마시클립 처리군에서 SA-β-gal 양성 세포 염색 수준은 대조군보다 높았고, 이는 아베마시클립이 인간제대정맥내피세포 상에서 세포 노화를 유도하였음을 시사합니다. 다음으로, 위암 세포주에서 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제로 인한 항신생혈관형성 효과 여부를 연구했습니다. 혈관 신생에 큰 영향을 미친다고 알려져 있는 혈관내피성장인자를 많이 분비하는 3개의 위암 세포주 및 생체 내 실험에서 아베마시클립 처리 후 CD31 발현이 감소한 세포주를 포함한 총 4개의 위암 세포주 선정하여 실험 진행하였습니다. 먼저, 아베마시클립 처리 후에 위암 세포주로부터 분비된 단백질의 발현 변화가 인간제대정맥내피세포의 관 형성과 증식에 어떠한 영향을 미치는지 실험적으로 확인했습니다. 대조군과 아베마시클립 처리군 사이의 관 형성에는 하나의 세포주에서만 30% 이상의 차이를 보였습니다. 또한, 몇몇 위암 세포주에서 아베마시클립을 처리 후 얻은 위암 세포주의 세포배양액을 이용한 인간제대정맥내피세포 증식 변화를 관찰한 실험에서 2개의 세포주에서 대조군보다 인간제대정맥내피세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였습니다. 혈관 신생에 가장 주요하게 영향을 미치는 인자인 혈관내피성장인자가 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제를 통해 발현 변화를 보이는지 확인하였습니다. 아베마시클립 처리 후 몇몇 위암 세포주에서 혈관내피성장인자 분비 혈관내피성장인자 단백질 및 mRNA 발현 감소를 관찰할 수 있었습니다. 결론적으로, 우리는 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제가 인간제대정맥내피세포 에서 G1 기 세포 주기 정지 및 세포 노화를 야기하는 것을 확인하였습니다. 또한, 일부 위암 세포주에서 VEGF를 포함한 혈관 신생 관련 인자의 발현을 변화시켜 인간제대정맥내피세포의 증식 또는 관 형성을 억제할 수 있다는 사실에도 불구하고, VEGF 전사를 통한 혈관 신생 억제 메커니즘은 입증되지 않았습니다. 하지만, 이 연구는 사이클린 의존성 인산화 효소 4 / 6 억제제가 신생혈관형성에 미치는 영향에 대한 새로운 관점을 제공했습니다.