Development and application of cell-based assay for Agrin antibody associated with myasthenia gravis

Abstract

Background: Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease that affects the neuromuscular junction and is primarily characterized by muscle weakness. About 90% of MG cases involve autoantibodies targeting the acetylcholine receptor (AChR) or muscle-specific kinase (MuSK). In cases lacking AChR or MuSK antibodies, 2–10% have autoantibodies against low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (LRP4). A subset of MG patients with or without AChR, MuSK, or LRP4 antibodies shows Agrin antibodies (Agrin-Abs). This study aims to develop an in-house cell-based assay (CBA) for the detection of Agrin-Ab and to apply the CBA in analyzing samples from individuals diagnosed with MG. Method: To develop the cell-based assay (CBA), used the pCMV6-AC-GFP vector with Agrin complementary DNA (cDNA) inserted. The Agrin vector was then transfected into human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells. Agrin expression validation involved RT-PCR for mRNA and western blotting for proteins. Transfected HEK293T cells were incubated with rabbit anti-human Agrin-Ab and subsequently incubated with goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa Fluor 594. Immunofluorescent staining evaluation was performed using fluorescence microscope. After CBA was successfully established, a total of 389 serum samples were tested. The sample included 340 patients with MG, 36 patients with other neuromuscular diseases, and 13 healthy controls. The presence of Agrin-Ab was determined by evaluation based on fluorescence intensity and co-localization in fluorescence microscopy. Results: Agrin mRNA and protein expression in Agrin-transfected HEK293T cells were confirmed by RT-PCR and western blotting. Fluorescence microscopy revealed the presence of green fluorescence along the cell membrane surface of Agrin-transfected cells, indicating that Agrin was expressed in the cell membrane. Upon Agrin-Ab addition, red fluorescence appeared, aligning with green fluorescence. Two of 340 MG patients (0.6%) tested positive for Agrin-Ab, including 1 of 191 AChR-positive patients and 1 of 54 MuSK-positive patients. Two MG patients presented with ocular symptoms early in their disease. One of them had a thymoma. They responded to prednisolone treatment. Conclusion: A cell-based assay (CBA) was developed to detect Agrin-Ab associated with myasthenia gravis. This CBA was used to determine the presence of Agrin-Ab in serum samples obtained from individuals diagnosed with myasthenia gravis. 배경: 중증근무력증(MG)은 신경근 접합부에 영향을 미치는 자가면역 질환으로, 근육 약화가 특징입니다. 아세틸콜린수용체(AChR) 또는 근육-특이-키나아제(MuSK)를 표적으로 하는 자가항체는 MG 사례의 약 90%에서 확인됩니다. AChR이나 MuSK에 대한 검출 가능한 항체가 없는 환자 중 2~10%는 저밀도 저밀도지단백수용체 관련 단백질4(LRP4)에 대한 자가항체를 나타냅니다. Agrin 항체(Agrin-Ab)는 AChR, MuSK 또는 LRP4에 대한 항체가 있거나 없는 MG 환자의 하위 집합에서 발견됩니다. 본 연구의 목표는 Agrin-Ab 검출을 위한 자체 세포 기반 분석(CBA)을 개발하고 MG 진단을 받은 개인의 샘플을 분석하는 데 CBA를 적용하는 것입니다. 방법: 세포기반분석법(CBA)을 개발하기 위해 Agrin 상보성 DNA(cDNA)가 삽입 된 pCMV6-AC-GFP 벡터를 사용하였습니다. 이어서, Agrin 벡터를 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포에 형질감염 시켰습니다. Agrin 발현의 검증은 mRNA에 대한 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 단백질에 대한 웨스턴 블랏(western blotting)을 통해 이루어졌습니다. 형질감염 된 HEK293T 세포는 Rabbit anti-human Agrin 항체와 함께 배양된 후 Alexa Fluor 594와 접합된 Goat anti- rabbit IgG와 함께 반응 시켰습니다. 면역형광염색의 평가는 형광 현미경을 사용하여 수행되었습니다. CBA가 성공적으로 확립된 후 총 389개의 혈청 샘플을 테스트했습니다. 이 샘플에는 MG 환자 340명, 기타 신경근 질환 환자 36명, 건강한 대조군 13명이 포함되었습니다. Agrin-Ab의 존재는 형광 현미경 검사법에서 형광 강도와 co-localization을 기반으로 평가하여 결정되었습니다. 결과: Agrin이 형질감염된 HEK293T 세포에서 Agrin mRNA와 단백질 발현의 확인은 각각 RT-PCR과western blotting으로 수행되었습니다. 형광 현미경 검사 결과 Agrin이 형질감염된 세포의 세포막 표면을 따라 녹색 형광이 존재하는 것으로 나타났으며 이는 Agrin이 세포막에서 발현되었음을 나타냅니다. Agrin-Ab를 첨가한 후 세포막은 녹색 형광과 일치하는 곳에 적색 형광 염색을 나타냈습니다. AChR 양성 환자 191명 중 1명, MuSK 양성 환자 54명 중 1명을 포함해 총 340명의 MG 환자 중 2명(0.5%)이 Agrin-Ab 양성 반응을 보였습니다. 2명의 MG 환자는 질병 초기에 안구 증상을 보였습니다. 그 중 한 명은 흉선종이 있었습니다. 그들은 프레드니솔론 치료에 반응했습니다. 결론: 중증근무력증과 관련된 Agrin-Ab를 검출하기 위해 세포 기반 분석(CBA)이 개발되었습니다. 이 CBA는 중증근무력증으로 진단받은 개인으로부터 얻은 혈청 샘플에서 Agrin-Ab의 존재를 확인하는 데 사용되었습니다.