Effects of exosomes derived from eutopic endometrial cells on cell proliferation and apoptotic pathway in endometriosis and the discovery of novel exosome related biomarkers for endometriosis

Abstract

Endometriosis (EMS) is an estrogen dependent disease, where tissue similar to the lining of the endometrium grows in other areas such as the ovaries, fallopian tubes, and peritoneal cavities. It commonly occurs in women of childbearing age and can cause complications such as infertility, but the pathogenesis has not been clearly identified, yet. Additionally, there is a high risk of recurrence, emphasizing the need for research on non-invasive biomarkers to enable urgent diagnosis. Exosomes, small extracellular vesicles with a diameter of 30-100 nm, are secreted from most cell types to reflect the internal state of cells and are known to play a crucial role in disease progression in various pathological processes. In addition, it encapsulates microRNA and is highly applicable as a diagnostic marker. Studies on the pathophysiology of endometriosis have partially reported the role of exosomes in mechanisms related to angiogenesis and immunity, but the mechanisms associated with cell proliferation and apoptosis remain unclear. In this study, we hypothesized that exosomes play a role by the autocrine effect, and related biomarkers were identified to confirm their potential as diagnostic markers. We collected eutopic endometrial tissues from patients with endometriosis (EMS-EM) and without endometriosis (CTL-EM) and cultured to primary cells. Exosomes were extracted from EMS-EM and CTL-EM, respectively, and then treated in vitro endometriosis model for 24 hours. Results from CCK-8 and FACS assays showed that exosome extracted from EMS-EM (EMS-Exo) treatment induced cell proliferation and reduced apoptosis. In particular, JC-1 red/green dye was significantly increased, and the mitochondrial apoptosis signal pathway was regulated by EMS-Exo treatment. The examination of protein expression identified that proliferation was induced through ERK and AKT signaling, and mitochondrial apoptosis signaling pathway was regulated through PI3K/AKT mechanism. To identify related microRNAs, we performed miRNA array analysis on exosomes collected from EMS-EM and CTL-EM cell. The results showed differences in 16 miRNAs, with hsa-miR-200a-3p upregulated and 29a-3p down regulated. These 2 miRNAs were found to be related to the PI3K/AKT mechanism. Furthermore, qRT-PCR was performed on serum exosomes for in vivo diagnosis, and significant differences were observed in 5 miRNAs. Finally, ROC curve analysis was conducted to identify the potential of these miRNAs as diagnostic biomarker, and 4 miRNAs showed diagnostic performance. However, in order to be commercially viable, a combination with increased sensitivity and accuracy needs to be identified. In conclusion, these findings suggest that the exosome-related mechanism influences the development of endometriosis and highlights the potential of exosomes as novel diagnostic biomarkers for endometriosis.

자궁내막증은 자궁내막과 유사한 조직이 난소, 나팔관, 복막강 등 다른 위 치에서 자라기 시작하는 에스트로겐 의존성 부인과 질병이다. 이 질병은 가임 기 여성에서 흔하게 발생하고 불임과 같은 합병증을 유발하지만 발병기전이 명확히 밝혀지지 않았다. 또한 재발위험이 높아 신속한 진단을 위한 비 침습 적인 진단 마커에 대한 연구가 필요한 상황이다. 엑소좀은 직경이 30-100nm인 작은 세포 외 소포체이며 대부분 세포유형에서 분비되어 세포의 내부 상태를 반영하고 다양한 병리학 과정에서 질병진행에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 microRNA를 캡슐화 하여 진단 마커로의 활용도가 높다. 자궁내막 증의 병태생리학 규명에 관한 연구에서 엑소좀의 역할에 대해 혈관 신생 및 면역에 관련한 기전에 대해선 일부 보고되어 있지만 세포 증식 및 사멸 관련 기전에서는 명확히 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 엑소좀의 자가분비 효과 에 의해 질병악화를 시킨다는 가설을 세우고 연관된 바이오 마커를 발굴하여 진단표지자로의 가능성을 확인하였다. 구체적으로 자궁내막증 환자와 대조군 으로부터 자궁내막 조직을 수집하고 일차세포로 배양하였다. 세포에서 각각의 엑소좀을 추출한 뒤 자궁내막증 모델에 24시간 처리하여 분자생물학적인 기법 을 통해 결과를 관찰하였다. CCK8과 FACS 분석 결과에서 자궁내막증 유래 엑 소좀이 세포증식을 유도하고 세포사멸을 감소시키는 것으로 나타났다. 특히, JC1 red/green 비율이 유의미하게 증가하였고 미토콘드리아 연관 세포사멸이 경로가 조절되는 것으로 나타났다. 단백질 발현을 조사한 결과, ERK, AKT 신 호전달을 통해 증식이 유도되었고, PI3K/AKT 기전을 통해 미토콘드리아 세포 사멸 신호경로가 조절된 것이 확인되었다. 관련 miRNA를 파악하기 위해 miRNA array 분석을 수행하였다. 그 결과 16개의 miRNA 가 차이를 보였고, hsa-miR200a-3p 가 상향 조절되고 29a-3p 가 하향 조절되었다. 특히, 이 두 miRNA는 PI3K/AKT 기전과 연관성이 있었다. 또한, 생체내 진단 활용을 위해 혈청 엑소 좀의 qRT-PCR를 수행하였고, 5개의 miRNA 가 유의차가 있었다. 마지막으로 진 단 바이오 마커로의 가능성 파악을 위해 ROC 커브 분석이 시행되었고, 4가지 miRNA 가 진단 성능을 보였다. 하지만 상용화를 위해선 민감도와 정확도를 높 인 조합을 찾을 필요성이 있다. 결론적으로, 본 연구는 분자생물학적 기법을 통해 엑소좀 자가분비 관련 주요 기전을 밝히고 이와 연관된 자궁내막증 진단 바이오 마커의 새로운 후보군을 제시하였다.