Patient-derived organoid model for prediction of cancer-risk in patient with germline mutation of mismatch repair genes

Abstract

대장암(CRC)의 약 10~15%가 현미부수체 불안정성(MSI) 종양을 보이고, MSI 종양의 약 20%가 '린치증후군 (Lynch syndrome)' 또는 '유전성 비용종증 결장직장암 증후군 (HNPCC)'으로 알려진 불일치 복구 (MMR) 유전자 MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM의 생식선 돌연변이에 의해 발생된다. 린치증후군 환자는 대장암 발병 위험이 높지만, 린치증후군 환자에서 암위험도는 실제 다양하게 나타나며, 암위험도를 예측할 수 있는 효과적인 모델이 없다. 따라서, 우리는 린치 증후군 환자 유래 오가노이드 (PDO)를 이용한 대장암 발병 위험도에 대한 개별화된 예측 모델을 계발하고자 한다. 우선 DNA 손상 유발 세포사멸반응을 기반으로 메틸화제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG)의 세포독성 효과에 대한 오가노이드 반응을 측정했다. 정상 대장 오가노이드에서 고농도/단기간 및 저농도/장기간의 MNNG를 처리하였고, 오가노이드 크기는 상대적으로 감소했지만 갯수에는 큰 차이를 보이지 않았다. MNNG의 효과를 높이고 대장 오가노이드의 세포 사멸을 유도하기 위해 O6BG와 ATR 억제제를 추가로 처리하였다. MNNG, O6BG 및 ATR 억제제를 같이 처리함으로써 세포독성 효과에서 MMR 유전자 돌연변이 오가노이드에 비해 정상 오가노이드가 민감하다는 것을 발견했다. 더 이른 단계에서의 빠른 변화의 차이 확인을 위해 DNA 손상 인식 마커인 γH2AX의 발현을 분석하여 DNA 손상 반응을 조사하였다. MGMT 억제제인 MNNG와 O6BG를 처리한 후, MMR 유전자 돌연변이 오가노이드보다 정상 오가노이드에서 γH2AX의 높은 발현을 발견했다. 또한, MNNG에 의해 유도된 돌연변이 수가 정상 오가노이드에 비해 MMR 유전자 돌연변이 오가노이드에서 상당히 증가하는 것을 발견했다. MNNG에 의해 축적된 돌연변이를 확인하기 위해, 생어시퀀싱 분석과 전장유전체분석 (Whole Genome Sequencing)을 진행하였다. 대장 오가노이드에 MNNG를 처리하고, 여러 회복 시간 별로 오가노이드를 얻어 분석을 진행하였다. 정상 오가노이드에서 시간에 따라 감소되는 염기 전위들을 발견할 수 있었지만 반면에, MMR 유전자 돌연변이 오가노이드에서는 증가되는 것을 발견했다. 더불어, 전장유전체분석 결과를 통해, MNNG에 의해 유도된 돌연변이 숫자가 MLH1 유전자 돌연변이 오가노이드에서 정상 오가노이드에 비해 상당히 증가되는 것을 발견하였다. 결론적으로, 린치 증후군 환자 유래 오가노이드 모델에서 MNNG와 O6BG에 의한 DNA 손상 반응 측정은 대장암 위험의 개별화된 예측 모델이 될 수 있다. About 10~15% of Colorectal cancer (CRC) shows MSI-tumor, and about 20% of MSI-tumor is caused by germline mutation of Mismatch repair (MMR) genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, and EPCAM, which is known as Lynch syndrome (LS) or Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer Syndrome (HNPCC). Although Lynch syndrome patients have a high risk of colorectal cancer, not all of them have the same risk of developing CRC even in the same pathogenic germline mutations of MMR gene. We suggest the individualized prediction model for CRC risk using Lynch syndrome patient-derived organoid (PDO). First of all, we measured organoid response to the cytotoxic effect of a methylating agent, N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine (MNNG), based on the DNA damage induced apoptosis. We treated colon organoids with various dose and period of MNNG. However, we could not find significantly rapid change of normal organoid growth. Then, to increase the effect of MNNG with induction of apoptosis in colon organoids, we additionally treated O6BG, MGMT inhibitor, and ATR inhibitor. We found that the cytotoxic effect by combined treatment of MNNG, O6BG and ATR inhibitor in normal organoids were higher than MMR gene mutated organoids, which was detected after several passage of organoids. Next, for early detection of differential change between normal organoids and LS-PDOs, we examined DNA damage response by analyzing the expression of γH2AX, which is a DNA damage recognition marker for detecting in earlier phase of DNA damage. Then, after treatment of MNNG and O6BG we found a higher expression of γH2AX in normal organoids than in the MMR gene mutated organoids. To identify the mutations that accumulated by MNNG, we performed the analysis of the Sanger Sequence and Whole Genome Sequence (WGS). We treated MNNG in colon organoids and harvest with several recovery times. We found that normal organoids showed decreased base transitions over time, however, LS-PDOs showed increased base transitions over time. In addition, according to analysis of WGS data, MNNG-induced mutation number was significantly increased in MLH1 gene mutated organoids, compared to normal organoids. In conclusion, the measurement of DNA damage response by MNNG and O6BG in Lynch syndrome patient-derived organoid model could serve as an individualized prediction model of CRC risk in Lynch syndrome patients.