Photo-crosslinked gelatin methacryloyl hydrogel strengthened with calcium phosphate-based nanoparticles by different methods for early healing of rabbit calvarial defects

Abstract

조직 공학에서 스캐폴드의 역할은 재생 과정에서 손상된 조직을 일시적으로 대체하는 것이다. 스캐폴드의 이상적인 특성으로서 세포증식 및 기능적 분화를 위한 환경 제공할 수 있어야하고, 기계적 지지를 필요로 한다. 현재까지 다양한 형태의 생체 재료가 세포조직과 세포활동을 조절하고, 대사물질 및 성장인자를 분배할 수 있는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 역할을 모방하기 위해 조직 공학 분야에서 연구되고, 개발되고 있다. 하이드로겔(hydrogel)은 세포외기질과 유사한 특성을 가진 스캐폴드로서 다양하게 연구되고 있다. 하이드로겔은 삼차원적 구조의 친수성기를 포함하는 생체물질로 합성고분자와 천연고분자로 제조될 수 있다. 합성고분자는 분해속도 및 기계적 물성을 조절할 수 있는 장점을 지니고, 천연고분자는 세포신호 조절 및 생분해능의 특성을 가지지만, 기계적 물성이 약하다는 단점을 지닌다. 따라서 이 두 물질의 장점을 이용하려는 연구들이 행해지고 있다. 최근, Gelatin methacryloyl(GelMa)는 바이오프린팅과 바이오제조 분야에서 다양하게 이용될 수 있는 생체물질로 주목받고 있으며, 여러 물질을 첨가함으로써 기계적인 물성과 분해 속도를 조절할 수 있는 특징을 가진다. 이러한 첨가물이 GelMa 하이드로겔의 기계적 물성을 개선시킬 수 있는지에 대해서는 여전히 논란의 여지가 있으나, 여러 연구들에서 실질적인 적용을 위한 개발이 시도되고 있다. 탄소 나노튜브와 산화 그래핀을 첨가한 연구에서는 이 재료들의 첨가가GelMa 하이드로겔의 강성을 높이는데 효과적임이 입증되었다. 또한 다른 연구에서는 금속 나노입자를 첨가했을 때 신생골 형성에서 유의미한 결과를 얻었다고 보고되었다. 이러한 선행연구에서 착안하여 본 연구에서는 인산칼슘을 기반으로 한 나노입자를 개발하였고, 이와 함께 합성한 GelMa 하이드로겔을 생체 내 모델에 처음으로 적용하여 이 재료가 골 재생을 향상시킬 것이라는 가설을 수립하였다. 따라서 본 연구는 나노입자로 강화된GelMa 하이드로겔의 골재생 효능을 연구하는 데에 목적을 두었으며, GelMa 하이드로겔에 나노입자를 첨가하는 제조 방식의 차이에 따른 골재생능과 생체적합성 및 분해 양상을 평가할 것이다. 총 10마리의 각 토끼 두개골에 직경 6mm의 구형 결손부 4개를 형성하였다. 각 결손부는 4개의 군으로 무작위로 할당되었으며, 첫번째 군은 아무 재료도 넣지 않은 대조군 (control group), 두번째 군은 가교결합된 GelMa 하이드로겔을 적용한 군 (GelMa group), 세번째는 나노입자와 GelMa 하이드로겔을 가교결합한 군 (CNp-GelMa group), 네번째는 나노입자와 GelMa 하이드로겔을 각각 합성한 뒤에 이를 혼합한 군 (CNp+GelMa group)으로 설정하였다. 결손부에 각 실험 재료를 적용하고, 2주에 4마리, 4주에 4마리, 8주에 2마리를 희생하였으며, 조직학적 분석과 방사선학적 분석을 통해 4개 군의 결과를 비교하였다. 방사선학적으로 관심영역 (ROI)을 trephine bur로 형성한 주변 경계를 기준으로 상부는 골막, 하연은 경막으로 설정하고, 분석 프로그램을 이용하여 전체 증강된 부피 (TAV, mm3)와 신생골 부피 (NBV, mm3)를 계측하였다. 조직학적으로는 광학 현미경을 통한 고배율 관찰과 더불어, 관심영역 (ROI) 내 전체 증강된 면적 (TAA, mm2)과 신생골 면적 (NBA, mm2)을 계측하였다. 조직학적 및 방사선학적 계측치의 통계적 비교는 각 치유 기간에 따른 비교를 위해 Kruskal-Wallis 검정을 시행하였고, 각 실험군 간의 비교는 Mann-Whitney 검정을 시행하였다(p<0.05). 임상적으로 양호한 치유 양상을 보였고, 실험 기간 동안 재료의 노출이나 감염으로 인한 염증반응은 보이지 않았다. 방사선학적 계측 결과, 신생골 부피 비교시 8주에서 CNp-GelMa 군에서 신생골이 가장 많이 형성됨을 확인하였으나 통계적으로 유의미한 차이는 없었다. 조직학적 관찰 결과에서도 CNp-GelMa군에서 가장 많은 신생골이 관찰되었으나, 면적 계측 결과에서는 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 2주에서 대조군과 비교했을 때 CNp-GelMa 군 (4.93±1.89 mm2, p=0.029)과 CNp+GelMa군 (5.05±1.11 mm2, p=0.029)이 전체 증강된 면적에서 통계적으로 유의하게 더 큼을 확인할 수 있었다. 신생골의 면적은 모든 치유기간동안 대조군과 비교했을 때 유의미한 결과를 얻지 못했다. 결론적으로, 나노입자로 강화된GelMa 하이드로겔의 제조 방식에 따른 골재생 효능은 차이가 없었다. 하지만, GelMa 하이드로겔과 비교했을 때 나노입자를 첨가한 GelMa 하이드로겔은 2주까지 결손부 내에 남아있었고, 거의 염증반응 없이 우수한 생체적합성을 보였다. 따라서 임상에 적용하기 위해서는 후속연구를 통해 재료의 기계적인 물성과 효소 분해에 대한 저항성을 개선해야 할 것이다. Purpose: The aim of this study was to investigate the efficacy of photo-crosslinked gelatin methacyloyl (GelMa) hydrogel and calcium phosphate nanoparticles (CNp) when applying different fabrication methods for bone regeneration. Methods: Four circular defects were created in the calvaria of 10 rabbits. Each defect was randomly allocated to the following study groups: 1) The sham control group; 2) The GelMa group (defect filled with crosslinked GelMa hydrogel); 3) The CNp-GelMa group (GelMa hydrogel crosslinked with nanoparticles); 4) The CNp+GelMa group (crosslinked GelMa loaded with nanoparticles). At two, four and eight weeks, samples were harvested, and histological and micro-computed tomography analyses were performed. Results: Histomorphometric analysis showed that CNp-GelMa and CNp+GelMa groups at 2 weeks were significantly greater in total augmented area compared to the control group (P<0.05). Greatest new bone area was observed in the CNp-GelMa group, however this was without statistical significance (P>0.05). Crosslinked GelMa hydrogel with nanoparticles exhibited good biocompatibility with minimal inflammatory reaction. Conclusion: There was no difference in the efficacy of bone regeneration according to the synthesized method of photo-crosslinked GelMa hydrogel with nanoparticles. However, these materials could remain within a bone defect up to 2 weeks and showed good biocompatibility with little inflammatory response. Further improvement in mechanical properties and resistance to enzymatic degradation would be needed for the clinical application.