Metabarcoding of bacteria and parasites in the gut of Apodemus agrarius

Abstract

Apodemus agrarius is a wild rodent found in fields in Korea, and it is known to carry various pathogens. To analyze the bacterial microbiome, amplicon next-generation sequencing (NGS) targeting the 16S rRNA gene is most widely used. Although many bacterial microbiome analyses have been attempted using feces of wild animals, there are still few studies have used NGS to screen for parasites. This study aimed to rapidly detect bacterial, fungal, and parasitic pathogens in the guts of wild mice using NGS-based metabarcoding analysis. We conducted 18S/16S rDNA-targeted high-throughput sequencing was conducted on cecal samples from A. agrarius (n = 48) collected in May and October, 2017. Taxa of protozoa, fungi, helminths, and bacteria in the cecal content were then identified. Of the protozoa, Tritrichomonas sp. was found in all the cecal samples, followed by Monocercomonas sp. (95.8%; 46/48 of samples) and Giardia sp. (75%; 36/48). For helminths, Heligmosomoides sp. was found in 85.4% (41/48) of samples, followed by Hymenolepis sp. (10.4%; 5/48) and Syphacia sp. (25%; 12/48). In 16S rRNA gene analysis, the microbial composition changed by season (p = 0.005). Linear discriminant analysis effect size analysis showed that Escherichia coli and Lactobacillus murinus were more abundant and that Helicobacter rodentium was less abundant in the mice collected in spring. Helicobacter japonicus was more abundant and Prevotella_uc was less abundant in males. Finally, microbial composition changed based on the Heligmosomoides sp. infection status (p = 0.019). Specifically, Lactobacillus gasseri and Lactobacillus intestinalis were more abundant in the Heligmosomoides sp.-positive group than in the negative group. This study demonstrated that bacterial abundance changed based on the season, specific parasitic infection status of collected mice. These results highlight the advantages of NGS technology in monitoring zoonotic disease reservoirs.

등줄쥐는 (Apodemus agrarius) 한국에서 흔히 발견되는 야생 설치류로 인간에게 신증후군출혈열, 렙토스피라증과 같은 설치류매개 감염병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져있다. 본 연구에서는 iSeq 100 차세대염기서열 분석 장비를 이용하여 야생 등줄쥐의 (Apodemus agrarius) 분변의 세균과 기생충 군집분석을 시행하고 병원체를 스크리닝 하였다. 군집분석의 타겟 유전자는 세균의 16S rRNA gene V4와 기생충의 18S rRNA gene V9이었다. 본 연구에 사용된 등줄쥐는 강원도 강릉과 원주에서 5월, 6월, 10월 채집하였으며 총 48개의 분변 DNA를 확보하였고 박테리아, 원생동물, 진균 및 기생충의 염기서열을 분석하였다. 원생동물에서 Tritrichomonas sp. 가 모든 샘플에서 확인되었으며 Monocercomonas sp. (95.8%; 46/48)이 두 번째로 가장 많았고, Giardia sp. (75%, 36/48)가 그 뒤를 이었다. 기생충의 경우, Heligmosomoides sp. 가 샘플의 85.4%(41/48)에서 발견되었고, Hymenolepis sp. (10.4%; 5/48), Syphacia sp.(25%; 12/48), Raillietina sp. (8.3%; 4/48) 및 Strongyloides sp. (6.3%; 3/48) 등을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 분석에서 모든 샘플은 Muribaculaceae의 존재가 지배적이었고, Lachnospiraceae가 그 뒤를 이었다. 또한, 미생물 조성은 계절(p=0.005)과 성별(p=0.001)에 따라 변화하였다. 선형 판별 분석 효과 크기 분석 (Linear discriminant analysis)에서는 봄철 채집된 생쥐에서 가을철 채집된 생쥐에 비해 Escherichia coli와 Lactobacillus murinus가 더 풍부하게 관찰되었다. 또한, Heligmosomoides sp. 감염 상태에 따라 미생물 조성이 변화하였다 (p=0.019). 추가적으로, Lactobacillus gasseri와 Lactobacillus intenseis는 음성군보다 Heligmosomoides sp. 양성군에서 더 풍부하였다. 이 연구는 수집된 쥐의 계절, 성별 및 특정 기생충 감염 상태에 따라 박테리아의 양이 변한다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 인수공통전염병 모니터링에서 NGS 기술의 장점을 강조한다. 본 연구결과는 메타바코딩 분석을 통한 선제적 감염 매개 동물 스크리닝 시스템 구축 개발에 중요한 자료가 될 것이다.