Sustainable haploidization of human cell lines by CRISPR/Cas-mediated allele-specific deletion of target genes

Abstract

CRISPR/Cas 시스템은 표적 영역에서의 정밀한 유전자 편집을 통해 유전자의 생물학적, 기능적 스크리닝을 가능하게 하는 가장 강력한 도구이다. 최근에는, 염기 교정자 및 프라임 교정자라는 유전자 가위가 생체 내에서 유전형과 표현형과의 관련성을 입증하기 위해 표적 위치에서 특정 염기를 삽입 또는 삭제하도록 응용되고 있다. 이와 맞물려 최근 KBM7과 HAP1을 비롯한 반수체 (n) 세포주가 개발됨에 따라, 그동안 교정되지 않은 대립 유전자가 표현형 변화를 가리는 현상을 방지하며 효율적인 표현형 스크리닝이 가능해졌다. 그러나 이러한 반수체 세포주의 배양 과정에서 이배체가 빠르게 확산되는 것으로 미루어, 반수체 상태가 불안정한 것으로 드러났다. 따라서, 이러한 반수체 세포주를 사용하는 대신, 이배체 세포주 내에서 특정 유전자에 한해 반수체를 도입하면 안정적으로 반수성을 유지할 수 있을 것으로 기대된다. 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)이 풍부한 영역을 대상으로 유전자 가위를 표적 것은 인간 이배체 내에서 관심 유전자에서 하플로타입을 유도하는 강력한 특이성을 제공할 것이다. 유전자 결실을 나타내는 인간 세포주를 단세포 수준에서 클로닝함으로써, 표적 유전자에서 지속 가능한 반수체를 갖는 이배체가 생성될 것으로 예상된다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 매개 DNA 이중 가닥 파괴에 의해 표적 유전자에서 대규모 유전자 결실을 유도했는데, 그 중에서도 BRCA2의 DNA 결합 도메인을 대상으로 한다. 단일 세포 샘플들의 실시간 정량적 PCR 결과는 표현형 스크리닝의 주요 대상이 될 수 있는 단일 대립 유전자를 제외하고, 해당 위치에서 대규모 유전자 결실을 일으킬 수 있음을 보여준다. 본 연구에서 확보한 단일 세포주의 BRCA2 유전자의 반수성 유지에 대한 검증을 위해서는, 해당 세포의 장기간 배양 및 수차례 검증 실험이 필요할 것으로 예상된다. CRISPR/Cas-system is one of the most powerful tools that enable biological functional screening via precise genome editing at the intended target regions. Up to date, base editors (BEs) and prime editors (PEs) are the most frequently used genome editing tools in inducing specific mutations at the target loci to demonstrate its relevance to the resulting phenotypes within host, both in vitro and in vivo. In line with this, recent development of haploid cell lines, including KBM7 and HAP1, has also enabled efficient genome screening by preventing unedited alleles from masking the phenotype changes. However, such cell lines showed unstable haploidy, being enriched in diploids during their long-term culture. Therefore, instead of using near haploid cell lines, introducing haplotype at gene-of-interest in diploids is expected to generate more sustainable haploidy. Targeting single nucleotide polymorphisms (SNPs)-enriched region would provide robust specificity to induce haplotype at the gene-of-interest within human diploid. By single cell cloning the human cell lines that exhibit CRISPR/Cas-mediated large deletions, diploids with sustainable haploidy at the target genes are expected to be generated. Here, we induced large deletion in BRCA2 by CRISPR/Cas9-mediated DNA double strand break, precisely targeting the DNA binding domain of BRCA2. The real-time quantitative PCR (RT-qPCR) results demonstrate the robust efficiency of large deletion in the target loci, resulting in gene-specific haploidy of BRCA2, which could be the ideal target for efficient functional screening. Relative expression levels of large deletion-induced BRCA2 in single cell samples show one sample with induced haploidy of BRCA2, which was identified by RT-qPCR amplification of each single cell. Although sustainability of its haploidy should be continuously monitored during a long-term culture, subsequent deep sequencing of haploidized BRCA2 loci would further validate its genotype in a sequence-specific manner.