The role of glycogen synthase kinase-3β in transforming growth factor β - mediated myofibroblast transdifferentiation of subconjunctival tenon fibroblasts

Abstract

목적: 본 연구는 결막하 테논 섬유 아세포의 형질전환 생장인자 베타 (transforming growth factor-β, TGF-β) 매개 섬유화 과정에서 글리코겐 생성효소 인산화 효소 3 베타 (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)의 역할을 알아보기 위해 진행되었다. 방법: TGF-β에 의한 결막하 테논 섬유 아세포의 섬유화 과정과 관련된 인자들 (fibronectin, collagen Iα, α-smooth muscle actin)과 GSK-3β의 발현을 확인하기 위해 Quantitative real-time PCR과 Western blot analyses를 사용하였다. 또한 GSK-3β 억제제인 CHIR 99021를 처리했을 경우 인산화 된 Smad2와 Smad3의 발현 정도도 분석하였다. CHIR 99021이 결막하 테논 섬유 아세포의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해 wound healing assay가 사용되었다. 모든 연구는 정상 안과 녹내장 안에서 채취한 결막하 테논 섬유 조직과 그 조직에서 배양한 결막하 테논 섬유 아세포를 이용하여 진행되었다. 결과: 결막하 테논 섬유 아세포의 섬유화 과정에서 확인할 수 있는 fibronectin, collagen Iα, α-smooth muscle actin의 발현은 TGF-β 처리 시 증가하였다. 이 인자들은 정상 안에서 채취한 조직과 비교하여 녹내장 안에서 채취한 조직에서 발현이 유의하게 증가하였다. 결막하 테논 섬유 아세포에 TGF-β를 처리한 경우 active form의 GSK-3β의 발현이 증가됨을 확인하였는데, CHIR 99021 처리를 하는 경우 이 active form의 GSK-3β뿐 아니라 TGF-β매개 섬유화 과정에서 확인할 수 있는 인자들의 발현 역시 감소함을 확인할 수 있었다. 결막하 테논 섬유 아세포에 CHIR 99021 처리를 하는 경우 인산화 된 Smad2/Smad2와 인산화 된 Smad3/Smad3의 비율이 감소하였으며, 결막하 테논 섬유 아세포의 이동 역시 억제되었다. 결론: 본 연구 결과는 TGF-β 매개 결막하 테논 섬유 아세포의 섬유화가 GSK-3β의 억제를 통해 조절된다는 것을 보여준다 이는 임상에서 녹내장 여과 수술 후 성공률을 높이기 위한 방법으로 GSK-3β 억제제를 활용해 볼 수 있음을 시사한다. PURPOSE: This study investigated the effect of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) inhibition on the fibrosis of human Tenon’s fibroblasts (HTFs) induced by transforming growth factor-β (TGF-β). METHODS: Quantitative real-time PCR and Western blot analyses were performed to determine the expression levels of molecules associated with the fibrosis of HTFs by TGF-β (fibronectin, collagen Iα, and α-smooth muscle actin) and GSK-3β. The levels of phosphorylated Smad2 and Smad3 were also analyzed in the presence of the GSK-3β inhibitor CHIR 99021. The wound healing assay was performed to determine the effect of CHIR 99021 on the migration of HTFs. All experiments were conducted using primary cultured HTFs or human tenon tissues obtained from normal subjects and patients with glaucoma. RESULTS: Treatment with TGF-β resulted in an increase in the levels of molecules associated with the fibrosis of HTFs. The expression levels of these molecules were higher in the tenon tissues obtained from patients with glaucoma than those from normal subjects. When the HTFs were treated with TGF-β, a significant increase in the active form of GSK-3β (Y216) was observed. A significant decrease in the active form of GSK-3β and molecules associated with fibrosis by TGF-β was noted in HTFs treated with CHIR 99021. CHIR 99021 treatment reduced the phosphorylated Smad2/Smad2 and phosphorylated Smad3/Smad3 ratios in HTFs and attenuated HTF migration. CONCLUSIONS: The results of this study demonstrated the effect of GSK-3β inhibition on the regulation of TGF-β–mediated fibrosis of HTFs, suggesting GSK-3β to be a potential target for maintaining bleb function after glaucoma filtration surgery.