Investigation of the mechanism for intratumor heterogeneity in non-small cell lung cancer

Abstract

종양내 이질성은 항암제 약제 내성과 치료 실패의 원인으로 알려져 있다. 이 연구를 통해 종양내 이질성과 관련된 임상적 특징과 클론 확장을 일으키는 바이오 마커를 찾고자 하였다. TCGA 편평세포폐암과 선암 코호트에서 단일염기변이, 복제수 변이, RNA 시퀀싱, 임상데이터를 얻었다. 서브클론의 수는 Sciclone 패키지를 통해 분석하였다. 차등 발현 유전자 분석을 통해 클론 확장을 유도하는 후보 유전자를 선정하였으며 이 후보유전자의 플라스미드를 비소세포암 세포주에 형질감염 시켜 세포배양을 하였다. 마지막으로 단일세포 RNA 분석을 통하여 종양내 이질성이 골수세포에 미치는 영향을 확인하였다. TCGA 데이터에서 병기 I–IV, 치료를 받지 않은 481명의 편평세포폐암, 493명의 선암 환자 정보를 얻었다. 서브 클론의 수는 체세포 변이 수, 종양 병기와 양의 상관 관계를 보였다. 남자, 흡연력이 있는 환자에서 서브클론의 수가 더 많았다. 차등 발현 유전자 분석을 통해 MTA1, FDG1 그리고 MSI1을 클론확장을 유도하는 후보 유전자로 선정하였으나 후속 세포배양 실험에서 해당 유전자를 형질감염 시킨 비소세포폐암 세포는 생존하지 못하였다. 단일세포 RNA 시퀀싱 분석에서 흡연자의 M2-유사 대식세포 1은 종양형성과정에서 감소하였으나, 고전적 단핵구, 비고전적 단핵구, 그리고 염증성 대식세포는 종양형성과정에서 증가하였다. 또한 M2-유사 대식세포 1, 고전적 단핵구, 비고전적 단핵구, 그리고 염증성 대식세포의 종양 형성과정에서의 비율 변화가 흡연 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이 연구를 통해 종양내 이질성이 종양 돌연변이 부하, 병기, 성별, 흡연과 관련이 있음을 확인하였다. 종양내 이질성은 종양내미세환경에 염증을 유발하여 염증성 골수 세포를 증가시킬 수 있다. “Intratumor heterogeneity (ITH)” is defined as the uneven distribution of genetically diverse tumor subpopulations within a tumor. We investigated the clinical implications of ITH, inferred from the number of subclones, and determined the mechanism of subclonal expansion. Single nucleotide variation, clinical data, copy number variation, and RNA sequencing data from The Cancer Genome Atlas-Lung Squamous Cell Carcinoma (TCGA-LUSC) and Lung Adenocarcinoma (LUAD) cases were obtained from the Genomic Data Commons data portal. The clonal status was estimated from the variant allele frequency of the mutated genes using the SciClone package. Candidate biomarkers for clonal expansion were inferred by analyzing the differentially expressed genes between the high and low clone groups, and their impact was evaluated in NSCLC cell lines. Finally, single-cell RNA sequencing analysis was performed to evaluate the impact of ITH on myeloid cells in the tumor microenvironment. Data from 481 LUSCs and 493 LUADs in stages I–IV that had not received any treatment for lung cancer were collected from the TCGA database. The number of subclones was positively correlated with the number of somatic variants and the cancer stage. The number of subclones was significantly higher in males (vs. females) and smokers (vs. never-smokers). MTA1, FDG1, and MSI1 were selected in the DEG analysis as candidate genes for inferring clonal expansion. In subsequent experiments, NSCLC cells transfected with each candidate gene were not viable. Single-cell RNA sequencing data showed a decrease in the proportion during tumorigenesis of smokers’ M2-like Macrophage 1. In contrast, classical monocytes, nonclassical monocytes, and proinflammatory macrophages increased in smokers during tumorigenesis. The differences between smokers and never smokers in proportion shift of M2-like Macrophage 1, classical monocytes, nonclassical monocytes, and proinflammatory macrophage were statistically significant. In conclusion, the findings from this study indicated that ITH is positively associated with the tumor mutational burden and cancer stage. Male sex and smoking are associated with high clonality. ITH may induce inflammation in the tumor microenvironment, promoting the proliferation of proinflammatory myeloid cells.