Establishment of liver fibrosis animal model by inducing hepatic stellate cell-specific TGFβ1 using LRAT promoter

Abstract

"Liver fibrosis is a common consequence of chronic liver damage. It is a symptom in which scar tissue formation is induced as hepatic stellate cells (HSCs), activated by various inflammatory factors, such as cytokines, lose retinol and are converted into proliferative, fibrogenic, contractile myofibroblasts. Activated HSCs perpetuate their fibrogenic phenotype and the inflammatory process by the secretion of several paracrine and autocrine factors, such as TGFβ1, a key cytokine in the activation of HSCs. In addition, they secrete and deposit excessive amounts of extracellular matrix (ECM) which induces fibrosis. In the small intestine, retinyl esters are incorporated in chylomicrons and after transport through the circulation taken up by hepatocytes. In hepatocytes, they are converted to retinol and subsequent binding to retinol binding protein 4 (RBP4) stimulates the release of the retinol-RBP4 complex back to the circulation. Via an unknown mechanism, retinol is transferred to HSCs, re-esterified, and stored in lipid droplets. Quiescent HSCs store retinol as retinyl esters, by the action of lecithin retinol acyltransferase (LRAT), in large lipid droplets. Therefore, HSCs are key cells that induce liver fibrosis, and HSCs can be targeted with LRAT. In terms of retinol metabolism in the liver, LRAT can be used as a marker for HSCs because it is specifically present in large amounts in HSCs, and can be used to identify HSCs in a quiescent state in animal models. In this study, we selected the site with the highest expression among the LRAT promoters operating specifically in HSCs, developed a system in which TGFβ1 is expressed by LRAT promoter activation, and endeavored to establish a mouse disease model in which liver fibrosis is induced by TGFβ1 by the developed system. First, liver fibrosis induction vectors were constructed using the LRAT promoter. In the HSC-originated Lx2 cell line, the expression efficiency of the LRAT promoter was compared by size from the eC-terminal region, and LRAT-400, which showed the highest expression, was selected as the final promoter. The Tet-on system was designed to activate the LRAT promoter when treated with doxycycline, and a vector was constructed to overexpress TGFβ1 when the LRAT promoter was activated by fusion of the mutated TGFβ1-2CS to the promoter. In the Lx2 cell lines, which originated from HSC, TGFβ1 expression increased as the LRAT promoter was activated, but in HepG2 and Hep3B cell lines of general hepatocyte origin other than HSCs, the change in TGFβ1 expression was non-significant. When confirmed with the supernatant obtained after inducing the LRAT promoter in each cell line, there was no change in HepG2 and Hep3B, but in Lx2, 3TP-lux increased, and PAI-1, a well-known downstream target of TGFβ1, also increased significantly. The same results were obtained when confirming the induction of fibrosis by TGFβ1, and a significant increase in fibrosis markers was also shown exclusively in Lx2 cells. As a result of inducing the operation of the LRAT promoter in mouse animal experiments, TGFβ1 expression was confirmed in the liver, and it was confirmed that fibrosis was induced by comparing the expression of alpha smooth muscle actin (α-SMA). This suggests a new method of producing a mouse liver fibrosis model that increases the induction of fibrosis by targeting HSCs. It is considered that it can be used as an effective animal model for screening fibrosis-inhibiting drugs.

간섬유화는 만성 간 손상에 의해 발생하는 일반적인 결과로, 사이토카인과 같은 다양한 염증 인자에 의해 활성화된 간성상세포(HSC, Hepatic stellate cell)가 근섬유아세포로 전환되면서 흉터 조직 형성이 유도되는 증상이다. 간섬유화 발생기전에서 간성상세포는 TGFβ1과 같은 사이토카인에 의해 활성화되며, 간성상세포의 활성으로 다량의 세포 외 기질(ECM, Extracellular matrix)이 분비되어 섬유화가 유도된다. 레티닐 에스테르는 소장에서 흡수되어 간세포로 이동하여 레티놀로 전환되며, 레티놀 결합 단백질 4 (RBP4)에 결합해 레티놀-RBP4복합체를 형성한다. 이 후, 레티놀은 휴지기의 간성상세포에서 레시틴-레티놀 아실 트랜스퍼 레이스 (LRAT)의 작용에 의해 다시 에스테르화되어 지질방울 (LD)에 장기적으로 저장된다. 이러한 간에서의 레티놀 대사측면에서 볼 때, LRAT가 간 세포 중 특히 간성상세포에 특이적으로 다량 존재하기에 간성상세포의 마커로 적용할 수 있으며, 동물 모델에서 휴지기의 간성상세포를 식별하는 역할을 수행할 수 있음을 의미한다. 따라서 본 연구자는 간성상세포가 간섬유화를 유발하는 핵심 세포이며 LRAT로 간성상세포를 표적 할 수 있다는 것에 주목하였다. 본 연구에서는 간성상세포에서 특이적으로 작동하는 LRAT promoter 중 가장 활성이 높은 부위를 선정하고, LRAT promoter 활성화에 의해 TGFβ1 이 발현되는 시스템을 개발하여 생체 외 실험에서 간성상세포 특이적으로 TGFβ1 이 발현됨을 확인하고, 개발한 시스템에 의해 TGFβ1에 의한 간섬유화가 유도되는 마우스 질병 모델을 수립하고자 하였다. 먼저 LRAT promoter를 이용한 간섬유화 유도 벡터를 제작하였다. 간성상세포 기원인 Lx2세포주에서, LRAT promoter를 c-terminal 영역에서부터 크기 별로 발현 효율을 비교하여 가장 높은 발현을 보인 LRAT-400을 최종 promoter로 선정하였다. Tet-on system에 의해 doxycycline을 처리하였을 때 LRAT promoter가 작동되도록 설계하였고, TGFβ1의 2CS 돌연변이 형태를 융합시켜 LRAT promoter가 작동되었을 때 TGFβ1 이 과발현되도록 벡터를 구성하였다. 간성상세포기원인 Lx2 세포주의 경우 LRAT promoter가 작동함에 따라 TGFβ1 발현이 증가하였으나, 간성상세포가 아닌 일반 간세포기원의 HepG2와 Hep3B 세포주에서는 LRAT promoter가 작동하지 않아 TGFβ1 발현에 변화가 유의미하지 않은 수준으로 나타났다. 각 세포주에 LRAT promoter를 유도한 후 수득한 상등액으로 분석하였을 때, HepG2와 Hep3B에서는 변화가 없고, Lx2 특이적으로 3TP-lux가 증가하며, TGFβ1 의 다운스트림으로 잘 알려진 PAI-1 또한 증가하였다. TGFβ1에 의한 섬유화 유도 여부를 분석하였을 때, 역시 Lx2 세포에서만 특이적으로 섬유화 마커들의 유의미한 증가를 보였다. 마우스 생체 내 실험으로 LRAT promoter의 작동을 유도하였을 때 간 내부에서 TGFβ1의 발현이 관찰되었고, 그로 인한 섬유화 유도를 α-SMA로 분석하였다. 이는 마우스 간섬유화 모델 제작의 새로운 방식을 제안하며, 간성상세포를 표적함으로써 섬유화 유도를 증가하여 섬유화 억제 약물 스크리닝에 효과적인 동물 모델로 사용할 수 있을 것으로 사료된다."