Osteogenic effect of porous hydroxyapatite scaffolds covered with 45S5 bioactive glass and poly(lactic-co-glycolic acid) composite microfiber

Abstract

A wide range of synthetic bone graft materials are being used as scaffolds in medical fields such as oral, craniomaxillofacial, and orthopaedic surgery. One of these materials is porous hydroxyapatite (HAp) scaffold, which possess both biocompatibility and osteoconduction properties. However, it is limited in terms of bioactivity and osteoinduction. On the other hands, 45S5 bioactive glass (45S5 BG) well known to high bioactivity, osteoconduction, and osteoinduction. Also, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is an biodegradable polymer that is well known for its properties including control the rate of degradation. These advantageous properties motivated our study, which aimed to improve the bioactivity and osteoinduction of HAp scaffold covered with PLGA/45S5 BG composite microfiber (HPB scaffold) and to investigate the characteristics of HPB scaffold as bone graft materials. For experimental purpose, HPB scaffold was prepared by fabricating sponge replica method and electrospinning method. The spinning time differed that it depends on the experimental group, including 10, 20, and 30 minutes. The characteristics of the HPB scaffold were analyzed using scanning electron microscopy-energy dispersive X-ray spectrometry (SEM-EDS), micro computed tomography (μ-CT), and thermogravimetric analysis (TGA). In addition, ion release was detected for 28 days by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-OES). Fibroblast and preosteoblast were cultured and assessed for cytotoxicity, proliferation and viability. To confirm osteogenic differentiation, alkaline phosphatase (ALP) activity, western blot, immunocytochemistry (ICC), and alizarin red s (ARS) staining were carried out. The results of each test were statistically analyzed with one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post hoc statistical test (p < 0.05). All HPB scaffolds had a cancellous bone-like structure and they were covered with a layer of composite microfibers containing 45S5 BG atoms (Si-Ca-Na-P) by SEM-EDS. TGA analysis of all HPB scaffolds was confirmed to contain the 45S5 BG in PLGA microfiber. Additionally, these scaffolds enabled to sustain release of Si, Ca, Na, and P ions for 28 days. Cytotoxicity of all HPB scaffold was no significantly difference. Cell proliferation of HPB scaffolds was increased from 1 day to 3 days (p < 0.05). In addition, cell viability on the HPB scaffolds was confirmed with LIVE/DEAD assay. ALP activity and western blot analysis indicated that HPB scaffolds with 20 and 30 minutes of coating induced higher levels of osteogenesis-related markers compared to other scaffolds (p < 0.05). Furthermore, ICC indicated osteopontin expression in HPB scaffolds. ARS indicated that HPB scaffolds with 30 minutes of coating were more effective than the other scaffold in terms of mineralization (p < 0.05). These results showed that HPB scaffold was successfully fabricated by two step process and 45S5 BG ions were released for 28 days. In addition, HPB scaffold supported both pre-osteoblast proliferation and osteoblast differentiation into bone gene expression to osteoblast phenotype. Therefore, HPB scaffold may be a potential bone substitute for osteogenic activity.

구강, 두개악안면, 정형외과 등 의료 분야에서 다양한 합성골 이식재가 스캐폴드로 사용되고 있다. 이러한 재료 중 하나는 다공성 수산화인회석 (HAp) 지지체로 생체적합성과 골전도 특성을 가지고 있다. 그러나 생체활성과 골유도 특성 측면에서 한계가 있다. 한편, 45S5 생체활성유리(45S5 BG)는 생체활성, 골전도, 골유도 특성이 높은 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)는 분해속도를 제어하는 특성으로 잘 알려진 생분해성 고분자이다. 이에 본 연구의 목적은 HAp 지지체의 단점을 보완하기 위해 PLGA/45S5 BG 복합 나노 섬유로 코팅된 HAp 지지체(HPB 지지체)를 제작하고 HPB 지지체의 특성을 심층적으로 분석하는 것이다. 연구를 수행하기 위하여 스폰지 복제법과 전기방사법으로 HPB 지지체를 제작하였다. 스피닝 시간은 실험군에 따라 10분, 20분, 그리고 30분으로 설정하였다. HPB 지지체는 주사전자현미경-에너지 X선 분광법, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영, 열중량 분석을 사용하여 분석하였다. 또한, 유도쌍 플라스마 질량분석법으로 이온 방출을 28일 동안 관찰하였다. L929세포와 MC3T3-E1 세포를 배양하고 세포 독성, 세포 증식 및 세포 생존력을 평가하였다. 골형성 분화를 확인하기 위하여 ALP 활성도, western blot, 면역세포화학법, Alizarin Res S (ARS) 염색을 시행하였다. 각 검정의 결과는 일원분산 분석과 Tukey 사후 통계 검정으로 통계적 분석을 시행하였다 (p < 0.05). 모든 HPB 지지체는 주사전자현미경-에너지 X선 분광법을 통해 다공성 구조를 확인하였고 45S5 BG/PLGA 복합 마이크로 섬유 층으로 덮여 있다는 것을 확인하였다. 또한, HAp 구성원소 (Ca과 P)와 45S5 BG 구성 원소(Si, Ca, Na과 P)를 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영법을 통해 HPB 지지체의 다공도는 89.2%로 해면골의 다공도와 유사하다는 것을 확인하였다. 모든 HPB 지지체의 45S5 BG/PLGA 마이크로 섬유는 열중량 분석에서 PLGA 마이크로섬유에 45S5 BG가 포함되었다는 것을 확인하였다. 또한, HPB 지지체는 28 일 동안 Si, Ca, Na, 그리고 P 이온이 지속적으로 방출한 것을 확인하였다. 모든 HPB 지지체의 세포 독성은 유의한 차이가 없었다. HPB 지지체의 세포 증식은 1일보다 3일에서 증가한 것을 확인하였다(p < 0.05). ALP 활성도와 western blot 분석은 HPB20과 HPB30 지지체가 다른 지지체들에 비해 더 높게 골 형성이 되었다는 것을 확인하였다(p < 0.05). 또한, 면역세포화학법을 통해 HPB 지지체에서 Osteopontin이 발현되었다는 것을 확인하였다. 마지막으로, ARS 염색에서 30분 코팅된 HPB 지지체가 다른 지지체들보다 광물화 측면에서 더 효과적인 것을 확인하였다(p < 0.05). 본 연구 결과, HPB 지지체는 스펀지 복제법과 전기방사법 두 가지 방법을 이용하여 성공적으로 제작하였다. 또한, 45S5 BG 구성 원소의 이온들이 서방형으로 방출된 것을 보여주었다. 또한, HPB 지지체는 골 유전자 발현으로 전조골세포의 증식 및 조골세포의 분화에 모두 효과적이었다. 따라서 HPB 지지체는 골 형성 활성을 위하여 잠재적인 골 대체물이 될 수 있음을 시사하였다.