The role of histone cytotoxicity in synovial inflammation

Abstract

Histones are cationic DNA-binding proteins released by cells during cell death processes, such as NETosis. In this study, we investigated the role of extracellular histones that regulate the functions of the synoviocytes and macrophages, which play essential roles in mediating chronic inflammation in rheumatoid arthritis. We used the synoviocyte cell line MH7A and the macrophage cell line THP-1 for this study. We evaluated histone-mediated cytotoxicity through 7-aminoactinomycin D (7-AAD) staining and lactate dehydrogenase (LDH) release assay. We also measured the levels of high mobility group box-1 (HMGB1) and ATP to investigate the production of damage-associated molecular patterns (DAMPs). Moreover, cells were administered with chondroitin sulfate to suppress histone-mediated cytotoxicity. We also compared the cytotoxic potential of the histone subtypes by analyzing the α1 domain of each core protein. Histones increased LDH levels and binding of 7-AAD in MH7A and THP-1 cells and increased the extracellular levels of ATP and HMGB1. Furthermore, chondroitin sulfate reduced histone-mediated cytotoxic effect on the cells. The H2B-α1 peptide showed the highest cytotoxicity among all histone subtypes. Moreover, we observed that the cytotoxicity decreased when arginine in H2B-α1 was replaced with citrulline. Histones induce lytic cell death, thereby leading to synovial inflammation of synoviocytes and macrophages by inducing the secretion of DAMPs, such as ATP and HMGB1.

히스톤은 DNA와 결합하는 양이온 단백질이며, NETosis 등의 세포 사멸시에 세포 밖으로 방출된다. 세포외 히스톤은 세포막에 손상을 일으켜 염증에 관여한다. 본 연구에서는 세포외 히스톤이 류마티스 관절염의 만성 염증에 중요한 역할을 하는 활막세포와 대식세포에 미치는 영향을 연구하였다. 활막세포 세포주로는 MH7A 세포와 대식세포의 세포주로는 THP-1 세포를 사용하였다. 히스톤에 의한 세포 사멸 정도를 확인하기 위해 7-아미노액티노마이신 D 염색과 젖산탈수소효소 방출을 측정하였다. 손상 연관 분자유형의 발생을 확인하게 위해 히스톤을 처리하고 HMGB1과 ATP를 측정하였다. 히스톤의 독성을 억제하기 위해 chondroitin sulfate를 투여하고 세포독성이 감소하는지 LDH release assay를 통해 확인하였다. 히스톤 독성을 일으키는 기전을 연구하기위해 히스톤 subtype에서 alpha1 펩타이드를 만들어 subtype들 간의 세포독성을 비교하였다. 본 연구를 통해 히스톤이 MH7A 세포와 THP-1 세포 내 젖산 탈수소효소 방출을 증가시키고, DNA에 강한 친화성을 갖는 형광 화합물인 7-아미노액티노마이신 D 양을 결합을 증가시켰다. 뿐만 아니라 세포외 ATP, HMGB1의 양을 증가시켰다. 반면, chondroitin sulfate는 히스톤 세포독성을 감소시키는 것을 확인하였다. 히스톤 subtype 중 H2Ba1 펩타이드가 가장 높은 세포독성을 보였으며, H2Ba1의 아르기닌을 시트룰린으로 바꾸었을 때 세포독성이 감소하는 것을 알 수 있었다. 종합적으로 보면, 히스톤은 활막세포와 대식세포에서 lytic 세포사멸을 유발하고, ATP, HMGB1 등을 분비하도록 하여 활막 염증에 관여할 것으로 생각되어진다.