A study on the changes in hepcidin in an animal model of anemia of chronic inflammation: mechanistic insights related to iron supplementation and hepcidin regulation

Abstract

만성 염증성 빈혈(anemia of chronic inflammation, ACI)은 환자의 부정적 예후와 연관된 것으로 알려져 있다. Hepcidin은 체내의 철 항상성을 조절하는 주요 조절 인자로, 주로 간에서 생성된다. 만성 염증 상태에서는 hepcidin이 증가하여 체내의 철이 활용 불가능한 ferritin의 형태로 세포 내에 저장되는데, 이로 인해 체내에 충분한 철 저장량이 있음에도 불구하고 철의 이용에 제한이 발생하여 적혈구 생성이 어려워지고, 빈혈이 발생하게 된다. 임상에서는 모든 종류의 빈혈을 철분 보충으로 치료하곤 하는데, ACI의 근본적인 원인을 고려하였을 때 이것은 적절하지 못한 치료법일 가능성이 있다. 따라서, 본 연구에서는 임상과 유사한 ACI 쥐 모델을 확립하고, 정맥 내 철분을 투여한 후 단기간에 걸쳐 간에서 hepcidin 및 그 조절 경로의 변화를 알아보는 것을 주요 연구 목표로 하였다. 또한 철분 투여로 인해 발생 가능한 산화 스트레스를 평가하고, 신장에서의 erythropoietin (EPO) 발현 및 erythroferrone (ERFE) 변화를 함께 살펴보고자 하였다. 동시에, knockdown HepG2 세포에 철을 처리하는 실험을 통해 hepcidin 조절 경로를 확인하고자 하였다. ACI는 Complete Freund’s Adjuvant (CFA)를 2주간 3회 복강 내 투여하여 유발하였다. 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (n = 30)는 다음의 3개 그룹으로 나누어 배정되었다: 대조-식염수군 (n = 10), CFA-식염수군 (n = 10), CFA-철분군 (n = 10). CFA 투약 시작 2주 뒤, 혈색소 수치가 기저치에 비해 >2 g/dL 감소한 경우 ACI가 유발된 것으로 보았다. ACI 쥐는 정맥으로 철분 (iron isomaltoside, 20mg/kg) 또는 동량의 식염수를 투여 받았다. 투약 3일 후, 혈액학적 변수, 염증 표지자, iron profile과 함께 간에서의 hepcidin 및 그 전사 조절 경로를 확인하였다. ACI 쥐에서는 빈혈과 함께 염증 표지자와 활성 산소의 증가가 확인되었다. 정맥 철분 투여 3일 뒤, 혈색소 수치에는 변화가 없었으나, 간 및 혈청에서 hepcidin 농도가 증가하였고, 간에서의 ferritin 증가도 확인되었다. 철분 투약은 간에서 ROS-generating NADPH oxidase-2 (NOX-2), NOX-4 및 superoxide dismutase (SOD)의 증가를 유발하였다. ACI 쥐의 간에서 interleukin-6/signal transducer and activator of transcription-3 (IL-6/STAT-3) 경로와 bone morphogenetic protein/Sma mothers against decapentaplegic (BMP/SMAD) 경로 활성화가 확인되었으며, 정맥 철분 투여는 IL-6의 증가 없이 ACI 조건 하에서 활성화 되어 있던 SMAD1/5와 STAT-3를 더 활성화시켰다. 철을 처리했을 때 HepG2 세포에서도 SMAD1/5와 STAT-3가 모두 활성화 되었으며, 소간섭 RNAs (short interfering RNAs, siRNAs)를 이용한 STAT-3와 SMAD1/5의 knockdown을 시행했을 때 철 처리로 인한 hepcidin 전사 증가 정도가 억제됨을 확인하였다. 정맥 철분 투여는 신장에서 EPO mRNA 발현량을 감소시켰으며, 이는 혈청에서의 ERFE 농도 감소와 동반되었다. 결론적으로, ACI 쥐 모델에서 정맥 철분을 투여하고 3일 뒤 혈색소 수치가 호전되지 않았는데, 이는 만성 염증 상태에서 증가해 있던 hepcidin이 철분 투약으로 인해 더 증가한 것과 연관되어 있을 수 있다. 실제로 철분 투약 후 간에서 hepcidin 및 ferritin의 유의한 증가가 확인되었다. 철분 투약 후 hepcidin의 발현 증가는 SMAD1/5 외에 STAT-3 관련 경로의 활성화와도 관련이 있음을 관찰할 수 있었는데, 철분 투여로 산화 스트레스 지표들이 증가한 것과 연관성이 있을 것으로 생각된다. 철분 투약 후 신장 EPO 발현 및 혈청 ERFE 농도가 동시에 감소하는 것은 ACI 조건 하에서 충분한 철분 보충에도 불구하고 효과적인 조혈 작용을 방해하는 적혈구 조절 인자들의 복잡한 상호작용이 발생함을 보여준다. 이러한 결과들을 고려할 때 만성 염증 상태에서 정맥 철분제 투약으로 빈혈을 효율적으로 치료하기 위해서는 hepcidin과 EPO 조절을 함께 고려하는 것이 도움이 될 것으로 생각한다.

Anemia of chronic inflammation (ACI), also known as anemia of chronic disease, is the second most frequent form of anemia in hospitalized patients and a harbinger of adverse health outcomes. Hepcidin, the master regulator of iron homeostasis, is expressed mainly in the liver and induces the degradation of ferroportin, the sole iron exporter. Chronic inflammatory conditions lead to an increase in the levels of hepcidin, resulting in a sequestration of iron inside cells in the form of ferritin, and this hinders iron utilization for erythropoiesis despite sufficient iron stores in the body. However, anemia is often clinically treated with iron supplementation, regardless of the underlying cause, with varying results in patients with ACI. Changes in hepcidin levels and activity in ACI patients have not been fully elucidated, and understanding them may provide new insights for planning treatment strategies. Thus, the primary aim of this study was to establish an animal model of ACI that resembled clinical ACI and use it to investigate changes in hepcidin and upstream regulatory pathways in the liver after intravenous (IV) iron supplementation. Additionally, we examined whether oxidative stress and concomitant changes in the major erythropoiesis-stimulating pathways involving erythropoietin (EPO) and erythroferrone (ERFE), was induced by iron supplementation. We also aimed to identify the role of signaling pathways upstream of hepcidin in HepG2 cells treated with iron using short interfering RNAs. ACI was induced in rats by intraperitoneal administration of Complete Freund’s Adjuvant (CFA, 0.2 mg in oil, 3 times/2 weeks). Male Sprague Dawley rats (n = 30) were randomly assigned to 3 groups: control-saline (n = 10), CFA-saline (n = 10), and CFA-IV iron (n = 10). Rats showing a decline in hemoglobin (Hb) levels >2 g/dL from baseline at 2 weeks after CFA administration were designated as ACI rats. ACI rats received iron (20 mg/kg of iron isomaltoside, CFA-IV iron) or vehicle (CFA-saline) intravenously. Three days after which changes in hematologic parameters, inflammatory cytokine levels, iron profiles, expression of proteins involved in signaling pathways upstream of hepcidin transcription, and iron metabolism gene expression were evaluated in the liver. ACI rats with anemia showed a concomitant increase in the expression of inflammatory mediators (i.e., interleukin [IL]-1β, IL-6, tumor necrosis factor-α [TNF-α]) and reactive oxygen species (ROS). Three days after IV iron administration, Hb levels in ACI rats did not fully recover to the corresponding baseline values. Hepcidin levels in the liver of ACI rats were upregulated with a concomitant increase in ferritin levels in the liver compared to those in CFA-saline rats. Iron supplementation also induced an increase in ROS-generating NADPH oxidase (NOX)-2, NOX-4, and superoxide dismutase in the liver compared to those in CFA-saline rats. In ACI rats, activity of the IL-6/signal transducer and activator of transcription-3 (IL-6/STAT-3) pathway and the bone morphogenetic protein/Sma mothers against decapentaplegic (BMP/SMAD) pathway were increased in the liver compared to those in vehicle treated rats. IV iron supplementation further increased SMAD1/5 phosphorylation and STAT-3 phosphorylation in CFA-IV iron rats compared to those in CFA-saline rats, while there was no difference in IL-6 expression between both groups. Iron caused phosphorylation of STAT-3 and SMAD1/5 in HepG2 cells, and knockdown of STAT-3 and SMAD1/5 using short interfering RNAs in HepG2 cells was found to be associated with diminished iron-induced upregulation in hepcidin transcription compared to that in the corresponding control cells. IV iron supplementation was also associated with decrease in EPO mRNA expression in the kidney and serum ERFE concentration in CFA-IV iron rats compared to those in control-saline rats. In conclusion, in this rat model of ACI, IV iron administration did not effectively ameliorate anemia within 3 days despite an increase in ferritin levels in the liver, which might be related to an additional increase in hepcidin levels that was already upregulated under chronic inflammatory conditions. Both STAT-3 and SMAD1/5 phosphorylation were found to be associated with hepcidin upregulation after IV iron treatment, and this is potentially linked to iron-induced oxidative stress. Concurrent reductions in renal EPO expression and serum ERFE activity after IV iron supplementation imply a complex interplay between erythroid regulatory molecules that hinders effective erythropoiesis despite sufficient iron supplementation under ACI conditions. These results provide primary evidence regarding the importance of hepcidin regulation and EPO availability in increasing the efficacy of IV iron supplementation for the treatment of anemia under chronic inflammatory conditions.