61 180

Cited 0 times in

Application of mutant enrichment technologies to improve the clinical sensitivity of plasma epidermal growth factor receptor testing in non-small cell lung cancer patients

Other Titles
 비소세포성 폐암 환자의 혈장에서 EGFR 유전자 변이 검출의 임상적 민감도 개선을 위한 변이 증강 기술의 적용 
Authors
 김보연 
College
 College of Medicine (의과대학) 
Department
 Dept. of Laboratory Medicine (진단검사의학교실) 
Degree
박사
Issue Date
2021-02
Abstract
표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)-티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI)는 EGFR 돌연변이를 가진 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자의 치료로 사용될 수 있다. 그러나 TKI 치료를 받은 환자들 중 치료 뒤 약 8~18개월 후에 치료 효과가 더 이상 나타나지 않는 현상이 나타나는 경우가 있으며 이는 주로 EGFR에서 exon20의 790번째 자리에 위치한 트레오닌이 메티오닌으로 대체되는 변이(p.Thr790Met, T790M)로 인해 발생하게 된다. T790M 변이가 있을 경우 T790M 표적치료제를 2차 치료로 사용할 수 있으므로 1차 TKI 치료를 받았으나 치료 효과가 없는 환자들로부터 T790M 변이를 민감하게 검출하는 것이 중요하다. 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)를 검출하기 위한 많은 기술적 플랫폼이 구현되고 있으나 ctDNA는 매우 적은 양의 DNA 조각으로 존재하므로 NSCLC 환자의 ctDNA로부터 EGFR 돌연변이를 검출하는 데에 어려움이 있다. 따라서 돌연변이 카피수가 유난히 적은 순환 핵산에서도 T790M과 같은 EGFR 돌연변이를 검출할 수 있도록 검출 능력이 향상된 기술의 필요성이 대두되고 있다. 최근 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열이라는 이름이 붙은 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)와 크리스퍼연관 단백질 카스9(CRISPR-associated protein 9, cas9) 시스템을 사용하여 돌연변이 증폭을 시킨 방법들이 분자 진단 분야에 소개된 바 있다. 이 논문에서는 T790M 카피수를 극도로 적게 가지고 있는(<10 copies/mL) NSCLC 환자의 세포유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)에서 T790M 돌연변이를 검출하기 위해 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 크리스퍼-카스9 시스템을 결합한 새로운 돌연변이 증폭 테크놀로지인 CRISPR-CPPC (CRISPR system combined post-PCR cfDNA)를 소개하였다. CRISPR-CPPC는 1) cfDNA PCR, 2) 미리 PCR 전처리 된 cfDNA (post-PCR cfDNA)와 cas9의 복합체로 조립, 3) 디지털 미세방울 방식 PCR (droplet digital PCR, ddPCR)인 세가지 스텝으로 이루어져 있다. CRISR-CPPC의 최적화 및 유효성검사는 참조 cfDNA 및 TKI 치료를 이미 받았으나 질환이 진행된 NSCLC환자의 cfDNA를 사용하여 수행하였다. 그리고 CRISPR-CPPC의 검출 민감도를 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR, qPCR) 및 ddPCR 결과를 CRISPR-CPPC 결과와 비교하였다. CRISPR-CPPC의 사용으로 T790M 돌연변이 카피수 증폭이 가능하였으며 그 외 대립유전자 빈도 (allele frequency) 또한 최대 약 13배 증가하게 되어 T790M 돌연변이를 민감하게 검출 할 수 있었다. 또한 질환이 진행된 NSCLC 환자에게서 CRISPR-CPPC 를 사용하여 T790M 변이를 검출하였을 때 CRISPR-CPPC의 민감도는 93.9%, 특이도는 100%로 확인되었다. CRISPR-CPPC의 성능은 현재 이용 가능한 다른 방법보다 훨씬 높다. 따라서 질환이 진행된 환자에게서 T790M 변이를 더 민감하게 검출 할 수 있도록 CRISPR-CPPC 기술을 사용하는 것은 임상의들에게는 NSCLC 환자를 치료하는데 적절한 치료를 선택할 수 있도록 도움을 줄 수 있으며, 환자에게는 T790M 표적 치료를 받을 수 있는 기회를 한번 더 제공해줄 수 있다는 점에 의의가 있다.

Epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI) has provided clinical benefits for non-small cell lung cancer (NSCLC) patients with the EGFR mutation; however, acquired resistance frequently appears after a median period of 8-18 months of TKI treatment. Sensitive detection of the p.Thr790Met (T790M) mutation is particularly important for patients who do not respond to first-line TKI because T790M-targeted therapy can be used as a second-line treatment. Although many technical platforms targeting circulating tumor DNA (ctDNA) are already being implemented in clinical practice, highly fragmented and low quantity ctDNA is an obstacle for detecting EGFR mutations in NSCLC patients. Therefore, there is a need for strategies to improve the detection capability for clinically significant mutant alleles with exceptionally low copy number among circulating nucleic acids. Recently, a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (cas9) system was introduced to the molecular diagnostic field as a mutant enrichment method. Here, we report a new mutant enrichment technology, CRISPR system combined post-polymerase chain reaction (PCR) cell-free DNA (cfDNA) (CRISPR-CPPC) to detect T790M mutation from the cfDNA of NSCLC patients with extremely low mutant allele copies (<10 copies/mL). The CRISPR-CPPC process is comprised of the following three steps: (1) cfDNA PCR, (2) assembly of post-PCR cfDNA and cas9 complex, and (3) droplet digital PCR (ddPCR). We preformed optimization and validation of CRISPR-CPPC using reference cfDNA materials and cfDNA from NSCLC patients who underwent TKI therapy. Then, we compared the detection sensitivity of CRISPR-CPPC with the results of real-time PCR (qPCR), and with the results of ddPCR without CRISPR-CPPC. Using CRISPR-CPPC, T790M mutant copies were sensitively detected by ddPCR, achieving about 13-fold increase in detected allele frequency. CRISPR-CPPC can detect T790M with 93.9% sensitivity and 100% specificity in patients with a progressive disease. When tested to patients with a progressive disease, CRISPR-CPPC’s performance is exceptionally higher than other currently available methods. This technology can be used to confirm the result of qPCR, which may facilitate selection of optimal treatment strategies, and provide extra opportunities to patients to receive T790M-targeted therapy.
Files in This Item:
TA02901.pdf Download
Appears in Collections:
1. College of Medicine (의과대학) > Dept. of Laboratory Medicine (진단검사의학교실) > 3. Dissertation
Yonsei Authors
Kim, Boyeon(김보연)
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/185157
사서에게 알리기
  feedback

qrcode

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

Browse

Links