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Tricarboxylic acid (TCA) 회로가 녹농균 elastase 생산에 미치는 영향 규명

Other Titles
 Regulation of Pseudomonas aeruginosa elastase production by tricarboxylic acid cycle 
Authors
 김동근 
College
 College of Medicine (의과대학) 
Department
 Department of Medical Science 
Degree
석사
Issue Date
2020
Abstract
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 만성 및 급성 감염을 유발할 수 있는 기회 감염성 세균이다. P. aeruginosa는 quorum sensing (QS)이라는 세포 밀도 의존적 방식으로 유전자 발현을 조절하는 박테리아 통신 시스템을 가지고 있다. P. aeruginosa는 많은 병원성 인자를 생산하며, 그중 다수의 병원성 인자는 QS에 의해 발현이 조절되고 있다. 주요 QS에 의해 조절되는 병원성 인자 중 하나는 lasB 유전자에 의해 암호화되는 elastase이다. 많은 연구에서 기능 손실 돌연변이가 보고되었으며, 이러한 돌연변이에서 elastase 생성이 줄어들어 있거나 또는 생성되지 않는다. 기존의 연구와 달리 우리는 더 높은 수준의 elastase를 생성하는 돌연변이를 찾고자 하였다. 우리는 elastase 과 발현 돌연변이를 통해 elastase 생산, 조절에 대한 새로운 관점을 제공할 수 있을 것을 기대하였다. 이를 위해, 우리는 random transposon mutagenesis를 통해 돌연변이를 제작하고, elastase 과 발현 돌연변이를 선별하였다. 선별된 돌연변이에서 transposon이 삽입된 위치를 arbitrary PCR을 통해 확인하였다. 이를 통해 tricarboxylic acid (TCA) 회로의 여러 효소 중 하나인 구연산 합성효소를 코딩하는 gltA 유전자에 transposon이 삽입된 돌연변이체(gltA::Tn)에서 elastase 발현이 증가하였다는 것을 알 수 있었다. gltA::Tn 돌연변이는 천천히 자라지만 야생형 균주인 PAO1보다 많은 양의 elastase를 생성한다. 우리는 gltA 유전자를 제거한 돌연변이(△gltA)를 제작하였고, gltA::Tn 돌연변이와 △gltA 돌연변이가 동일한 elastase 발현 수준을 보이는 것을 확인하였다. 또한 gltA 유전자가 결실되었을 때 어떠한 유전자의 발현이 달라지는지를 전반적으로 확인하기 위해 PAO1과 △gltA에 대해 RNA sequencing을 수행하였고, 흥미롭게도 비정상 TCA 회로를 보상하기 위해 TCA 회로를 우회하는 대안적인 경로에 관여할 것으로 예상되는 유전자들이 △gltA 돌연변이에서 크게 증가되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 (i) TCA cycle 활성이 elastase를 생산하는 박테리아의 능력과 관련되어 있고, (ii) QS에 의해 조절되는 elastase 생산이 야생형 균주에 비해 낮은 세포 밀도에서 이루어질 수 있음을 시사한다. 우리는 P. aeruginosa에서 TCA 회로에 의해 매개되는 에너지 대사가 어떠한 메커니즘을 통해 elastase 발현을 조절할 수 있는지에 대해 밝히고자 한다. Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause both chronic and acute infections. Quorum sensing is a bacterial communication system that regulates gene expression in a cell density-dependent manner. P. aeruginosa produces many virulence factors, many of which are regulated by QS. One of the major QS-regulated virulence factors is elastase, encoded by lasB. Many studies reported loss-of-function mutations that resulted in reduced or abrogated elastase production. Herein, we sought to identify a mutant that produces higher level of elastase. We postulated that identification of such mutants may provide novel insights into the regulation of elastase production. To this end, we performed a transposon (Tn) mutagenesis screen and isolated a mutant with elevated elastase production. Tn insertion occurred in the coding region of gltA gene encoding a TCA cycle enzyme, citrate synthase. The gltA::Tn mutant grows slowly but produces more amount of elastase than PAO1, its parental strain. We constructed in-flame deletion gltA(△gltA) mutant and confirmed that both gltA::Tn mutant and △gltA mutant show same elastase expression level. We conducted RNA sequencing and interestingly alternative pathway is extremely increased in △gltA mutant which might for compensating the abnormal TCA cycle. Together, these results suggest that (i) TCA cycle activity is associated with bacterial capability to produce elastase and (ii) elastase production can be achieved at low cell density. We are expecting to figure out how TCA cycle-mediated energy metabolism can regulate elastase expression in P. aeruginosa.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 2. Thesis
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/181148
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