Alleviation of neuropathic pain by glial regulation in the insular cortex of rats

Abstract

Studies on the role of neuroglia in neuropathic pain have been carried out, but a majority of studies have been done at the level of the spinal cord. The insular cortex (IC) is known to process pain information. However, the analgesic effects of inhibition of glia in the IC remain unexplored. Therefore, the aim of this study was to reveal the pain alleviation effects by inhibition of astrocytes or microglia in the IC during the pain development. Two experiments were conducted to evaluate pain relieving effects. 1) Consecutive administration of fluorocitrate (FC, astrocyte inhibitor, 1 nM) and minocycline (MC, microglia inhibitor, 20 μM) seven times into the IC immediately after nerve injury (early inhibition). 2) Seven repetitive application of each drug after establishment of pain (late inhibition). Mechanical allodynia was measured for 14 days. Western blot analyses were performed to evaluate expression changes of glial fibrillary acidic protein (GFAP), cluster of differentiation molecule 11b and c (CD11b/c) and purinergic receptors (P2X4 receptor (P2X4R) and P2X7 receptor (P2X7R)) in the IC. Furthermore, morphological quantification measures were performed by using immunofluorescence labeling and identified the cells expressing P2X4R and P2X7R. As a result, both early and late inhibition of astrocytes and microglia was effective in attenuating the pain. Interestingly, early inhibition of microglia showed enduring analgesic effects, persisting after drug withdrawal. Both GFAP and CD11b/c expressions were decreased after injection of FC or MC, respectively. In addition, morphological alterations of astrocytes and microglia were observed after FC or MC injection. The expression of purinergic receptors, which are associated with glial activation were increased during pain development in the IC. Furthermore, the P2X4R was expressed in neurons, astrocytes and microglia whereas the P2X7R was predominantly exhibited in microglia in the IC. These findings indicate that suppression of astrocytes and microglia in the IC alleviates the development of neuropathic pain. Additionally, alterations of P2X4R and P2X7R imply that purinergic signaling in the IC may be involved in pain development. 뇌섬엽피질(insular cortex, IC)은 통증과 관련된 많은 뇌 영역 중에서 통증의 불쾌한 감정 정보를 처리하는 영역으로 알려져 있다. 특히 IC는 통증을 식별하고 통증 강도에 비례하는 활성 변화를 나타냄으로써 통증과의 밀접한 연관성을 갖는 뇌 부위이다. 신경계는 통증 신호를 직접적으로 전달하는 뉴런 외에도 이 세포들을 지지하며 영양을 공급하는 신경아교세포(glial cell)로 구성되어 있다. 최근 연구들을 통해 신경아교세포는 기존에 알려진 역할 외에도 통증 신호 전달에 핵심적인 조절자 역할을 함이 밝혀지고 있다. 특히 별아교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 활성 조절을 통한 통증 완화는 각각의 신경아교세포를 조절하는 시기에 따라 상이한 결과들을 보였다. 이에 따라 만성 통증 상황에서 대뇌 수준에서의 신경아교세포의 변화를 확인하고, 통증의 발달 시기에 따라 이를 조절하는 연구를 통해 효과적인 새로운 치료 표적을 밝혀내는 것이 필요하다. 본 연구는 말초 신경이 손상된 Sprague-Dawley 흰쥐를 이용하여, 신경병증성 통증 발달 과정에서 IC의 별아교세포와 미세아교세포의 활성 억제를 통한 통증 완화 효과를 규명하고자 하였다. 이를 위하여 두 가지 연구를 진행하였다. 첫 번째로, 신경병증성통증 발달 초기 단계에서 7일간 fluorocitrate (FC, astrocyte 활성 억제제, 1 nM)와 minocycline (MC, microglia 활성 억제제, 20 uM)을 IC에 주입하고 기계적 이질통을 관찰하였다. 두 번째로, 신경병증성 통증이 형성된 후 IC에 7일간 FC와 MC를 주입하고 기계적 이질통을 관찰하였다. 서로 다른 시기에 신경아교세포의 억제에 따른 차이를 확인하기 위하여 western blot 검사와 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. FC와 MC에 의한 별아교세포와 미세아교세포의 활성 억제는 신경병증성 통증 발달의 초기단계와 신경병증성 통증 형성 이후 단계의 억제 모두에서 통증 완화 효과를 보였다. 별아교세포의 활성지표인 GFAP는 신경병증성 통증 쥐의 IC에서 유의미하게 증가하였으며, 약물 주입 후 발현량이 감소되었다. 특히, 신경병증성 통증 발달 초기 단계에서의 미세아교세포 활성 억제는 MC 약물 주입 중단 6일 후까지 진통효과가 지속 되었다. 미세아교세포의 활성지표인 CD11b/c는 신경손상 쥐의 IC에서 MC 주입에 따른 유의미한 발현량 감소를 나타내었다. 또한, 신경아교세포의 형태학적인 분석을 통하여 FC와 MC 주입에 따른 별아교세포와 미세아교세포의 활성 감소 정도를 관찰하였다. 신경아교세포의 활성 억제에 따른 진통 효과는 신경아교세포 활성에 관여하는 퓨린수용체(P2X)의 변화에서 기인한 것이라 추측할 수 있다. 신경병증성 통증 발달 초기의 퓨린수용체의 발현량은 P2X4 수용체와 P2X7 수용체 모두 유의미하게 증가하였으며, FC와 MC 약물 주입에 따라 감소하였다. 퓨린수용체의 발현량 변화는 신경아교세포의 활성과 기계적 이질통의 변화와 비슷한 경향성을 나타내었다. 면역 조직 화학 염색 분석 결과 P2X4 수용체는 별아교세포와 미세아교세포, 신경세포 모두에서 발현됨을 확인하였으며, P2X7 수용체는 미세아교세포에서 더 많이 발현됨을 확인하였다. 이러한 결과는 IC에서 FC와 MC 주입을 통한 별아교세포와 미세아교세포의 활성 억제가 신경병증성 통증을 완화 시킬 수 있음을 나타내며, 신경병증성 통증 발달 초기 단계에서 신경아교세포에 특정하게 발현되는 퓨린수용체의 억제는 신경병증성 통증 조절의 중요한 수단일 수 있음을 시사한다.