Anti-cariogenic Effect of Experimental Resin Cement Containing Ursolic Acid Using Dental Microcosm Biofilm

Abstract

Secondary caries was reported as the main cause of replacement of composite resin restorations. To solve this problem, there have been numerous attempts to add anti-cariogenic materials into composite resin. Among those materials, ursolic acid (UA) was reported to inhibit the growth of cariogenic microorganisms and biofilm formation, which suggests that UA have considerable antibacterial agents for dental caries prevention. Furthermore, anti-carious effect of UA around the composite resin restoration was reported consequently. In previous study, experimental resin cement containing UA was also reported to exert anti-cariogenic activity against S.mutans. However, there has been no study to evaluate the anti-cariogenic activity of resin cement against dental microcosm biofilms so far. Thus, this study was designed to evaluate anti-cariogenic activity of resin cement containing ursolic acid (UA) against caries-related microcosm biofilms and to determine the optimal concentration of UA. Experimental resin cement was prepared according to UA concentration (0, 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 wt%). Fifty extracted human molars were prepared with a 2 mm x 4 mm x 2 mm (M-D width x B-L width x depth) cavity on the occlusal surface. For each sample, an indirect resin inlay was made of TesceraTM system (Body A1 shade, Bisco, Schaumberg, IL, USA) following the manufacturer’s instructions. Then, Indirect resin inlays were cemented with experimental resin cement for each sample. Acid-resistant nail varnish (Wakemake, Seoul, Korea) was applied, except for the area 2 mm around the restoration. Dental microcosm biofilms were initiated from human saliva on extracted human molars to reflect conditions that are relevant to dental caries. Before biofilm growing, bacterial composition of human saliva was analyzed by 16s RNA microbiome profiling. Bacterial composition was shown normal range of oral microflora. There was no evidence of contamination in human saliva inoculum. Biofilms were then grown for 10 days in basal medium mucin (BMM) artificial saliva medium to induce artificial caries. To evaluate the caries progression, Quantitative Light-induced Fluorescence (QLF) was used to compare the before and after caries induction. One-way ANOVA followed by the Tukey post-hoc analysis was used to statistically analyze the data (p < 0.05). ΔF (-%) represents the relative mean loss of fluorescence of lesion comparing to sound enamel, the more negative value means the greater mineral loss and caries progression. ΔQ (-%⋅Px) represents total fluorescence loss volume of the lesion area. It was calculated as a multiplication of the lesion area (pixel) and the mean change in fluorescence (-%). On ΔF (-%) and ΔQ (-%⋅Px) values as QLF parameters, there was no significant ΔF changes after caries induction. Otherwise, there was a tendency of ΔQ (-%⋅Px) changes after caries induction being lower in groups of resin cement containing higher concentration of UA. The difference between before and after caries induction of ΔQ in control group was -3660.6 but the value of 2% group was only -404.8. It means that artificial caries was less induced in the area around resin cement containing UA of more than or equal to 1.0% significantly (p<0.05). There was no difference between the groups containing UA of more than or equal to 1.0%. In the previous study that evaluate anti-cariogenic activity against S.mutans, resin cement containing UA of more than or equal to 0.5% showed statistically significant anti-cariogenic activity. Within the limitations of this study, resin cement containing at least 1.0% of UA showed an anti-cariogenic effect. 이차 우식은 복합 레진 수복의 주요한 실패 원인인 것은 많이 알려져 있고, 이것을 극복하기 위해 복합 레진에 항우식 효과를 가진 물질을 넣는 연구가 활발하다. 그 중에서도 우르솔릭산은 triterpenoids의 일종으로 앞선 연구에서 S.mutan에 대해 우르솔릭산을 함유한 실험용 레진 시멘트가 항우식 효과가 있다고 밝혀졌다. 이에 본 연구에서는 우르솔릭산을 포함한 실험용 레진 시멘트를 이용하여 실제 임상과 유사한 조건의 구강 내 혼합균종에 대해서 항우식 효과가 있는지 입증하고, 항우식 효과를 위해 적절한 우르솔릭산의 농도를 알아보고자 한다. 5가지 농도의(0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 wt%) 우르솔릭산을 포함한 실험 레진 시멘트를 준비하고, 치아 시편은 발거된 인간의 대구치 50개로 준비한다. 발거치의 교합면 상에 2mm x 4mm x 2mm (가로 x 세로 x 깊이) 크기로 와동을 형성하고 간접 수복용 레진 인레이를 제작하여 각 시편에 실험용 레진 시멘트로 접착하였다. 간접 수복용 레진 인레이는 TesceraTM system (Body A1 shade, Bisco, Schaumberg, IL, USA)을 이용하였고 제조사의 지시대로 제작하였다. 그 후 수복물 주변 2mm 밖으로는 산 저항성 네일 바니쉬를 도포하여 수복물 주변의 치질에 대한 우식 정도만 평가하고자 하였다. 구강 내 혼합균종을 포함한 마이크로코즘 바이오필름을 유도하기 위해 24시간 이상 구강 위생 관리를 하지 않은 건강한 성인 남성의 사람 타액을 모아 치아 시편에 접종하였다. 세균 배양 전 타액의 균종 분석을 시행한 결과 정상 세균총 범주의 균종들이 검출되었다. 치아 시편에 타액을 접종하기 전 특별한 오염의 증거가 없음을 확인하였다. 치아 시편에 타액 접종하고 37 ℃ 혐기 조건으로 4시간 배양한 후, 타액은 흡인하여 제거하고 basal medium mucin (BMM) 와 0.5% 설탕이 혼합된 배양액을 첨가하였다. 배양액은 24시간마다 교체하였고, 총 10일 간 배양하여 치아 시편에 인공 우식을 유도하였다. 우식 전후로 정량적 광 유도 형광법 (QLF, Quantitative Light-induced Fluorescence)을 이용하여 우식 진행 정도를 비교하였다. 이후 통계분석을 통해 우르솔릭산의 농도에 따른 우식 유도 정도를 정량적으로 분석하여 우르솔릭산의 항우식 효과를 확인하고자 한다. 상기의 실험 결과는 일원 변량 분석 및 Tukey 사후 검정 통계 분석법으로 분석하였다. QLF 지표인 ΔF (-%) 와 ΔQ (-%·Px) 값은 우르솔릭산 함유 농도가 증가함에 따라 우식 유도 후에 변화량이 감소하는 경향을 나타냈다. 이러한 경향은 ΔF 보다는 ΔQ에서 더 뚜렷하게 나타났는데 대조군의 ΔQ의 우식 유도 전후의 변화량은 -3660.6인데 반해, 2% 우르솔릭산 농도 그룹의 값은 -404.5로 나타났다. 이는 우르솔릭산이 인공 우식 유도를 억제했다는 의미로 해석할 수 있다. ΔF 에서는 우르솔릭산 함유 농도가 증가함에 따른 우식 유도 후의 변화량이 통계적으로 유의차가 없었던 반면, ΔQ에서는 통계적으로 유의차가 있었다 (P<0.05). 여기에서 1.0% 이상의 우르솔릭산을 함유한 레진 시멘트에서 인공 우식이 수복물 주변의 치질에서 통계적으로 유의하게 적게 유도되었다는 것을 알 수 있다 (P<0.05). 하지만 1.0% 이상의 우르솔릭산을 함유한 실험군 사이에 유의미한 통계적 유의차는 없었다. 본 연구의 결과에 의하면, 우르솔릭산을 함유한 레진 시멘트는 1.0% 이상의 우르솔릭산을 함유한 레진 시멘트에서 항우식 효과를 나타내었다.