Red Blood Cell Generation for Diagnostic Reagents Using Induced Pluripotent Stem Cells Co-cultured with the OP9 Cell Line

Abstract

There are many blood group antigens on the surface of red blood cells (RBCs). The antibodies against these blood group antigens which are called unexpected antibodies can cause acute and delayed hemolytic transfusion reactions. Therefore, it is important to detect unexpected antibodies before transfusion and prepare the appropriate blood products. However, reagent RBCs used during the unexpected antibody tests are made from donated whole blood, so the surface antigens of the reagent RBCs change with the donor. This change causes an inconsistency in the reagent RBCs’ blood group antigens. In vitro RBC production of reagents is emerging as an alternative method of acquiring RBCs to produce more consistent antigen test results. Several different methods have been developed to produce human RBCs. One source of RBCs is stem cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a type of pluripotent stem cell that can be generated directly from adult mature cells. The iPSCs are considered to be an unlimited source because they can reproduce. This study was conducted to test a method of generating RBCs from iPSCs. It was hypothesized that in vitro cultured RBCs would express blood group antigens on the surface which would react with antibodies. The iPSCs for this study were obtained from peripheral blood mononuclear cells through reprogramming using five transcription factors. The iPSCs were differentiated by co-culturing with the OP9 cell line to produce erythrocytes. During the differentiation process, differentiation trends were observed through microscopic analysis and flow cytometry analysis. On the last day of differentiation, hemoglobin electrophoresis and oxygen-binding capacity assay were conducted to verify that the generated RBCs were functioning. Then, the reactions of the generated RBCs to antibodies were tested to confirm that the RBCs expressed blood group antigens. Cells received from six donors are well produced into iPSC showing stemness characteristics and iPSCs were able to differentiate into the erythroid lineage. Hemoglobin electrophoresis was performed on cultured RBCs and showed a high peak in the hemoglobin F region. No significant difference was observed in oxygen binding capacity assay between normal RBCs and cultured RBCs. In the case of blood group antigen test, it was confirmed that the same expression was observed between the donors’ RBCs and cultured RBCs. The blood group antigens of cultured RBCs reacted well with antibodies, which indicates that RBCs can be made from iPSCs for diagnostic purposes. 적혈구 표면에는 수많은 혈액형 항원이 존재한다. 환자의 체내에는 다양한 혈역형 항원에 대한 비예기항체가 생성될 수 있는데, 특히 임상적으로 중요한 비예기항체는 급성 및 지연성 용혈성 수혈부작용의 원인이 된다. 따라서 수혈전 비예기항체를 검출하고 이에 따라 적절한 혈액제제를 준비하는 것이 중요하다. 비예기항체 검사를 위한 시약 적혈구는 헌혈을 통해 공급되는데 제조 때마다 공혈자가 바뀜에 따라 시약 적혈구의 항원도 매번 바뀌는 결과를 초래한다. 이는 비예기항체 검사 결과의 일관성을 저해하는 요인으로서 진단시약을 위한 체외 적혈구 생산기술을 통해 검사 결과의 일관성을 유지할 수 있다면 적혈구 체외생산은 효과적인 대안으로 생각될 수 있다. 체외에서 적혈구를 생산할 수 있는 원료 중 줄기세포가 있다. 그 중 역분화줄기세포는 성인세포로부터 얻을 수 있는 줄기세포로, 자기 재생능력으로 인해 적혈구를 무한정 생산할 수 있는 잠재력이 있다. 본 연구에서 역분화줄기세포로부터 적혈구를 분화시켜 진단용 적혈구 시약을 생산하고자 하였으며, 체외에서 생산된 적혈구에서 비예기항체와 반응 가능한 혈액형 항원을 표현할 것이라는 가설을 수립하였다. 말초혈액단핵구로부터 5개 전사인자의 형질도입을 통해 역분화줄기세포를 제작하였고, OP9 세포주와 공배양을 통해 적혈구로 분화시켰다. 분화과정을 확인하기 위해 주기적으로 현미경검사와 유세포검사를 하였으며, 마지막에 헤모글로빈 전기영동시험과 산소결합능 검사를 시행하였다. 혈액형 항원 발현을 혈청학적 방법으로 검사하였다. 연구 결과, 6명 기증자로부터 기증받은 말초혈액에서 역분화줄기세포를 생산하였으며, 적혈구로의 분화를 성공하였다. 체외생산적혈구는 헤모글로빈 전기영동시험 결과 F 영역에서 피크를 보였으며, 정상적혈구와 체외생산적혈구의 산소결합능은 유의미한 차이를 보이지 않았다. 혈액형 항원을 검사한 결과 체외생산적혈구는 기증자의 원 적혈구의 항원과 동일한 혈액형 항원을 표현하고 있었다. 이번 연구를 통해 체외생산적혈구가 비예기항체와 반응 가능한 혈액형 항원을 발현하고 있음을 확인하였으며, 역분화줄기세포 유래 적혈구 진단시약의 제작 가능성을 제시하였다.