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Improvement the rituximab production by O-GlcNAcylation using Thiamet G

Other Titles
 Thiamet G를 이용한 O-GlcNAc결합에 의한 리툭시맵의 생산량 증가 
Authors
 김혜연 
College
 College of Medicine (의과대학) 
Degree
석사
Issue Date
2019
Abstract
O-형 당사슬 결합은 CHO세포에서 생성된 재조합 단백질에서 발생하지만, 이 현상은 광범위하게 연구되지 않았다. 본 연구는 리툭시맵이 O-형 당사슬결합인 N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc)이 결합하는 단백질이라는 것을 처음으로 규명하였다. 리툭시맵에는 O-GlcNAc이 결합하는 아미노산인 세린과 트레오닌이 풍부하게 존재하는데, O-GlcNAcase (OGA)의 억제제인 thiamet G를 처리하는 경우 생산량이 두배로 증가하고 반대로 O-GlcNAc 전이 효소 (OGT)를 억제 하였을 때는 생산량이 감소하였다. 35S 메타이오닌을 이용한 단백안정성 실험에서 thiamet G를 처리했을 때 rituximab의 단백안정성이 증가하는 것으로 나타났다. OGlcNAc- 특이적 항체를 이용해 thiamet G 처리에 의해 리툭시맵의 O-GlcNAc결합 증가를 확인하였고, N-acetyl-azido-glucosamine (Ac4GlcNAz)을 사용한 메타볼릭 라벨링을 통해 리툭시맵이 O-GlcNAc 결합하는단백임을 재확인하였다. 단백질 질량분석으로, 리툭시맵 경쇄의 세린 7, 12 및 14는 O-GlcNAc이 결합함을 발견하였는데 그 중 S12A 돌연변이는 리툭시맵의 안정성을 감소시켰을 뿐 아니라 thiamet G에 의한 생산량 증가를 보이지 않는 결과를 보여 12번 세린의 O-GlcNAc 결합이 rituximab의 단백안정성을 통한 생산량 조절에 중요한 부위임을 규명하였다. 세포 독성 및 열 안정성 분석을 통해 thiamet G를 처리하여 생산한 리툭시맵의 생물학적 및 물리적 특성에 차이가 없음을 확인함으로써 thiamet G 처리는 리툭시맵의 기능을 크게 변경시키지 않고 생산성을 향상시킬 수 있는 효과적인 방법임을 증명하였다. 한편, 경쇄의 12번 세린은 2종의 항 PD1 항체에서 보존되어 있을 뿐 아니라 이들 2종의 항체 역시 thiamet G에 의한 생산이 증가함을 발견하였다. 이상의 결과는 thiamet G의 처리에 의한 세린12의 O-GlcNAc결합은 리툭시맵 및 세린12를 갖는 항체들의 생산량을 증가시키는 방법으로 사용 될 수 있음을 시사한다. O-Glycosylation occurs in recombinant proteins produced by CHO cells, but this phenomenon has not been studied extensively. Here, we report that rituximab is an O-linked N-acetyl-glucosaminylated (O-GlcNAcylated) protein. The abundance of serine and threonine in rituximab, which are sites for OGlcNAcylation, led us to develop a method to increase production using thiamet G, an inhibitor of O-GlcNAcase (OGA). The production of rituximab doubled with OGA inhibition and decreased with O-GlcNAc transferase (OGT) inhibition. The radioactive isotope experiment revealed that the degradation of rituximab was reduced when thiamet G was treated. O-GlcNAc-specific antibody confirmed the increased O-GlcNAcylation with thiamet G and metabolic labelling using N-acetylazido- glucosamine (Ac4GlcNAz) confirmed that rituximab is an O-GlcNAcylated protein. Protein mass analysis revealed that serine 7, 12, and 14 of the light chain were O-GlcNAcylated. S12A mutation of the light chain decreased rituximab stability and failed to increase production with thiamet G. This revealed that serine 12 is an important factor for regulation of rituximab production. Cytotoxicity and thermal stability assays confirmed that there were no differences in the biological and physical properties of rituximab produced by thiamet G treatment. Therefore, thiamet G treatment improves the production of rituximab without significantly altering its function. Meanwhile, we found that serine 12 of light chain also conserved in anti- PD1 antibodies and showed increased production by thiamet G. Our results suggest that O-GlcNAcylation of serine12 by treatment with thiamet G could be used as a way to increase the production of rituximab and antibodies with serine 12.
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URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/178172
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