PKCK2에 의하여 조절되는 PKCK2 특이 기질 동정

Abstract

암전이란 암세포가 원발 암이 발생한 장기에서 다른 장기로 이동하는 현상을 말하며 이러한 암전이 과정에서 암세포는 침윤성과 운동성을 갖게 된다. 이때 발생하는 현상이 Epithelial mesenchymal - transition (EMT)라 하며, E-to N-switching은 EMT가 발생할 때 중요한 전제 조건이다. Protein kinase casein kinase 2 (PKCK2)는 세포 내에서 여러 다른 기질 단백질들을 인산화 함으로써 세포성장, 증식, 자멸사, 노화 등 많은 생리기전에 관여한다고 알려져있다. 또한 최근 보고에 따르면 PKCK2는 EMT에도 관여하여 암전이와 침윤현상을 조절한다고 알려져있다. 이러한 PKCK2는 특히 사람의 암 조직이나 암 세포 주에서 그 활성이 증가되어 있다. 따라서 본 연구팀에서는 PKCK2를 표적으로 하는 항전이 분자표적 치료제를 개발 중에 있다. 분자표적치료제 개발은 개발 약물 투여 대상 환자 군을 선별 가능하게 하는 predictive biomarker의 발굴 (companion diagnostics의 개발)과 병행되어야 한다. 그러므로 PKCK2를 표적으로 하는 분자표적 치료를 시행하기 위해서는 전이의 위험성을 가지는, 즉 PKCK2의 활성이 높은 환자 군을 선별할 수 있는 PKCK2 특이 기질을 발굴하여 진단 marker로써 개발하여야 한다. 하지만 여러 암 세포 주에서 기본적인 PKCK2활성과 catalytic subunit인 CK2의 단백질 발현 수준을 확인한 결과 PKCK2활성과 비례하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 PKCK2활성 증가에 따라 그 발현 양의 차이를 보이며, 그 활성을 대변해 줄 수 있는 기질을 발굴하여 임상에서 원발 암 조직의 PKCK2활성을 간접적으로 제시해 줄 임상 진단 marker를 개발하여야 한다. 그러므로 본 연구에서는 여러 PKCK2 기질 단백질들을 스크리닝 하여 PKCK2활성에 따라 변화하며 그 활성을 대변해 줄 수 있는 기질 단백질을 제시 함으로써 임상에서 고 위험 환자 군을 선별 할 수 있는 biomarker로 사용되어질 가능성을 제시하고자 한다. 우선, 세포 내에서 가장 직접적으로 PKCK2 활성을 측정할 수 있는 in vitro kinase assay를 수행하여 각 세포의 PKCK2 활성을 측정 하였다. 하지만 in vitro kinase assay는 세포의 추출물을 사용하며 -32P 를 사용하는 실험이므로 임상에서 진단도구로 사용하기에는 한계가 있다고 판단되었다. 다음으로 여러 암 세포 주 내의 epithelial marker인 E-cadherin과 mesenchymal marker인 N-cadherin의 발현 수준을 확인하였다. PKCK2의 활성에 따른 N-cadherin은 발현 수준은 큰 연관성이 없었으나, PKCK2활성과 E-cadherin의 발현감소가 높은 연관성이 있음을 확인할 수 있었다. 다음으로 본 연구팀의 선행연구 결과 PKCK2의 기질임을 밝힌 ZEB1의 발현수준을 여러 세포 주 내에서 확인해 보았다. 그 결과 유방암과 폐암 세포 주에서 ZEB1이 상대적으로 높은 발현 수준을 가지나, 대장암과 위암 세포 주에서는 낮은 발현 수준을 보였다. 이러한 ZEB1의 발현 차이가 PKCK2활성에 의한 것인지 또는 기본적인 ZEB1의 발현 수준이 다양한 조직 유래 세포 내에서 다양하게 존재 하기 때문인지 확인할 수 없었다. 그러므로 기본적인 발현 수준이 다른 ZEB1을 PKCK2 활성을 대변해주는 marker로 사용할 수 있을 지는 좀 더 연구가 필요할 것으로 생각된다. 마지막으로 PKCK2 활성을 간접적으로 측정 할 수 있는 후보 기질 단백질로써 CDC37에 대한 검증을 진행하였다. PKCK2의 인산화 기질로 알려진 CDC37의 인산화 정도를 확인해 본 결과 본 연구에서 PKCK2는 CDC37을 인산화하여 그 안정성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 이와 상응하게 PKCK2활성에 따라 12개의 세포주중 10개의 세포에서 CDC37 및 phospho-CDC37의 발현 수준이 연관성이 있음을 확인하였다. 위의 연구 결과들을 종합 하여 볼 때 전이가 빈발하는 대장암, 위암, 유방암, 직장암의 여러 세포 주에서 E-cadherin과 CDC37, phospho-CDC37이 PKCK2활성과 높은 수준의 연관성을 가지며, PKCK2 활성을 대변할 수 있음을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 임상에서 E-cadherin, CDC37 그리고 phospho-CDC37에 대한 immuno-histochemistry를 통하여 전이 고 위험 환자 군을 보다 신속하고 정확히 진단 할 수 있는 marker로 사용되어질 수 있는 가능성을 제시할 수 있었다.