전기방사된 콜라겐-히알루론산 나노 섬유 지지체 제작과 인간 골수 유래 중간엽줄기세포의 배양

Abstract

본 연구는 잠재적 세포 독성이 없는 조직공학/재생의학을 위한 콜라겐-히알루론산 나노 섬유 지지체를 제작하기 위한 방법을 고안하기 위해서 진행되었다. 세포외기질(Extracellular Matrix, 이하 ECM)을 구성하는 물질인 콜라겐과 히알루론산을 이용한 지지체의 경우 세포의 부착, 성장, 이동을 원활하게 해준다. 또한 지지체로 사용할 때 ECM 물질을 사용하는 것이기 때문에 면역반응이 적으며 분해가 용이하다는 장점이 있다. 따라서 콜라겐과 히알루론산을 이용한 지지체 제작과 관련하여 많은 연구가 진행되었다. 그 중 전기방사를 이용한 방법의 경우, 수 나노미터에서 수 마이크로 미터에 이르는 섬유상의 구조를 얻을 수 있기 때문에 ECM의 구조와 유사한 형태의 지지체를 제작할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 기존 연구에서는 콜라겐과 히알루론산 지지체를 제작하기 위해서 formic acid, N,N-dimethyl formamide, 그리고 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFP)과 같은 유기용매, 유독성 용매를 사용하여 진행되었다는 단점이 있다. 이러한 용매들이 지지체 내부에 남아 세포독성을 나타낼 수 있기 때문에, 이것을 해결하기 위한 방법으로 본 연구의 조건을 수립하게 되었다. 고농도의 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)와 에탄올을 이용하여 용매를 만들어 콜라겐과 히알루론산을 녹여 전기방사하여 나노 섬유 지지체를 제작하였다. 콜라겐의 농도를 15%(w/v)로 고정하고 히알루론산의 농도는 각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1%(w/v)로 하는 용액으로 전기방사를 진행하였다. 전기방사의 조건은 다음과 같다.; 1) 전압: 20kV, 2) 바늘의 크기: 18게이지 3) 용액 주입 속도: 0.5ml/h, 4) 집전판의 회전속도: 300rpm, 5) 주사기 바늘과 집전판 사이의 거리: 10cm 위의 조건으로 전기방사를 진행하여 최소 607.687nm, 최대 722.01nm에 이르는 나노 섬유 구조의 지지체를 제작하였다. 이후 지지체의 분해를 늦추기 위해 50mM의 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide용액에서 12시간 동안 가교한 뒤 사용하였다. 이때 가교 후 지지체에 생긴 작용기의 변화를 FT-IR을 통해 확인하였다. 지지체에 부착하기 위한 세포로는 인간 골수 유래 중간엽줄기세포를 사용하였다. 이는 임상시험에도 적용되고 있는 세포로써, 현재 활발하게 이용되고 있는 줄기세포이기 때문에 이를 사용하였다. 세포를 배양하기 위한 방법으로 조직배양플라스크와 더불어 생물반응기를 도입하였다. 생물반응기의 경우 세포의 대량 증식이 용이하다는 장점이 있다. 생물반응기 도입을 위한 배양조건을 설정하기 위하여 세포 밀도, 세포 배양 기간을 달리하여 배양 후 세포의 형태, 세포 수, 세포의 활성을 비교하였다. 이후 세포 밀도를 15,000cells/cm3, 세포 배양 기간을 7일로 하는 조건을 수립하였다. 이렇게 배양한 세포를 멸균된 지지체에 분주하여 세포의 부착을 확인하였다. 조직배양플라스크와 커버글라스를 대조군으로 하여 지지체에 대한 세포의 부착을 비교하였다. 1일 이후 세포의 부착정도를 확인하였다. 이후 3일간 배양한 후 세포의 부착, 분포, 및 형태를 각각 현미경, crystal violet 염색법, SEM을 통해 확인하였다. 모든 조건의 지지체에서 세포가 부착된 것을 확인할 수 있었다.