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Osteoinduction of human ligamentum flavum by osteoinductive gene therapy

Other Titles
 골형성 유전자 전달에 의한 척추 황색 인대에 골화 유도 
Authors
 김상곤 
Issue Date
2004
Description
Dept. Medicine/석사
Abstract
[한글]

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)는 골형성에서 중요한 역할을 하고 있다. 임상적으로 혹은 실험적으로 BMP-2는 척추 골유합에서 그 효용성이 증명되었다. 퇴행, 비후된 척추 황색인대는 주로 척추관 협착증의 병리기전으로만 알려졌으므로 골형성을 유도하는 조직공학적 접근은 시도된 적이 없다. 그리하여 본 실험적 연구는 퇴행, 비후된 인간의 척추황색인대와 아데노바이러스 표식 유전자전달체 및 아데노바이러스 BMP-2유전자 전달체 그리고 유전공학적으로 제조된 BMP-2를 이용하였다. 본 연구의 목적은 인간 척추황색인대의 표식유전자 전달 가능성과, BMP-2와 BMP-2 유전자 전달에 의한 척추황색인대의 골화 현상을 규명하기위함이다. 퇴행, 비후된 인간의 척추황색인대와 장골능에서 채취된 자가골을 이용하였으며 각각에서 척추황색인대세포와 조골세포가 분리배양되었다. 아데노바이러스 표식 유전자전달체 (Ad/luciferase, Ad/lacZ) 및 아데노바이러스 BMP-2유전자 전달체 (Ad/BMP-2)가 제작되었으며 유전공학적으로 인간의 BMP-2 cDNA를 Chinese hamster ovary세포에 전이시킴으로서 재조합된 BMP-2를 생산하였다. 인간의 척추황색인대 세포를 다양한 농도의 Ad/lacZ, Ad/luciferase, Ad/BMP-2, BMP-2에 노출시켰고 전달유전자 발현검사로 X-gal 염색, b-galactosidae 염색, Western blot, Northern Blot을 시행하였고 골형성능의 증명을 위해 alkaline phosphatase염색, Von Kossa 염색, Alizarin Red-S 염색, 면역조직학염색을 시행하였다. 생체내 효과를 알기위해 유전적으로 조작된 인간 척추황색인대 조직을 nude mouse에 이식하였다. 표식유전자가 전달된 황색인대 세포에서는 농도의존적으로 표식유전자가 발현되었으며 Ad/BMP-2와 BMP-2를 투여한 군에서도 역시 농도의존적으로 BMP-2 mRNA가 발현하였고 이에 따라 Osteocalcin mRNA도 발현증가하였다. 더구나 골형성 염색에서도 농도의존적으로 양성반응을 보였다. 이상의 연구 결과로 인간의 척추황색인대는 유전적 조작이 용이 하였으며 이는 새로운 연구 영역을 개척했다고 볼 수 있다. 그리고 BMP-2, Ad/BMP-2는 명백히 척추황색인대의 골형성을 촉진시켰다. 결론적으로 BMP-2 혹은 BMP-2 유전자 치료는 척추 황색인대 골화를 촉진하며 이는 척추 유합술에서 자가골이식을 대체할 수 있는 가능성을 제시한다.



[영문]Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) was widely known as a pivotal agent for osteoinduction. Clinically and experimentally, BMP-2 proved to be effective in spinal fusion. Since degenerated LF has only been implicated as a pathophysiological significance in spinal stenosis, LF tissue engineering for osteogenesis to achieve spinal fusion has not attempted before. In vitro experiment was performed using human ligamentum flavum (LF), adenovirus lacZ construct, adenovirus BMP-2 construct, and recombinant human BMP-2. The objectives of this study were to demonstrate the feasibility of marker gene to human LF cells and the effect of BMP-2 and Ad/BMP-2 on osteogenic differentiation of human LF cells. Human LF and cancellous bone from ilium were harvested from patients with lumbar spinal stenosis. LF cells and osteoblasts were isolated and cultured. Adenovirus lacZ construct (Ad/lacZ), adenovirus luciferase construct (Ad/luciferase), and adenovirus BMP-2 construct (Ad/BMP-2) were produced. Also human recombinant BMP-2 was synthesized by transfecting human BMP-2a cDNA to Chinese hamster ovary cells. Then LF cell cultures were exposed to various concentrations of BMP-2, Ad/lacZ, and Ad/BMP-2. Transgene expression of lacZ was assessed by X-gal stain, β-galactosidase assay, Western blot analysis, and Northern blot analysis. Alkaline phosphatase, von Kossa, and Alizarin red-S stains were utilized to confirm osteogenic differentiation and bone nodule formation. Immunocytochemical staining was also performed to detect expression of osteocalcin. Genetically modified human LF tissue with Ad/BMP-2 was implanted into nude mouse to test in vivo osteogenic effect. The LF cell cultures transduced with Ad/lacZ showed extensive expression of X-gal and increased β-galactosidase activity compared to viral (Ad/luciferase) and saline controls. In the LF cultures treated with BMP-2 or Ad/BMP-2, there were robust expression of alkaline phosphatase, bone nodule formations as evidenced by positive von Kossa and Alizarin red-S stains, and a strong expression of osteocalcin. The osteogenic response of LF cells to BMP-2 or Ad/BMP-2 was dose dependent. Human LF cells were susceptible to adenovirus–mediated marker gene transfer, which opens new research arena for genetic modification of LF. In human LF, BMP-2 clearly upregulates expression of osteogenic phenotypes and induces bone nodule formation. Furthermore, genetic modification using osteoinductive gene (BMP-2 cDNA) rendered upregulation of osteogenic phenotype in human LF and de novo osteogenesis in experimental animal. The results of this study support the notion that biologically modified LF i.e., LF treated with BMP-2, LF with adenovirus-mediated BMP-2 cDNA gene transfer can be a substitute for autogenous bone graft in spinal fusion.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 2. Thesis
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/137953
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