Specific differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into cardiogenic cells by PKC regulation

Abstract

[한글]

적절한 자극 하에 중간엽 줄기세포는 in vivo와 in vitro에서 근육세포, 연골세포, 지방세포, 조골세포, 건 세포 그리고 조혈 유지 기질로의 분화가 가능한 다기능 세포이다. 5-azacytidine에 의해 유도된 심근세포 분화가 가능한 결과임에도 불구하고, 중간엽 줄기세포에서 심근세포 분화를 기초로 하는 분자 기작들은 잘 알려져 있지 않다. 손상된 심근의 효과적인 재생을 위하여, MSCs의 in situ 심근세포 분화를 개선시키는 생리학적 방법을 찾는 것이 중요하다. 단백질 키나아제 C (PKC)는 배아 줄기세포의 심근세포 분화를 수반하는 신호변환 요소 중 하나이다. 본 연구에서는, 중간엽 줄기세포의 심근세포로 분화에서 PKC 활성체인 phorbol myristate acetate (PMA)의 역할을 조사하였다. PMA효과를 증명하기 위해, 1 μM PMA를 처리한 중간엽 줄기세포는 각각 2, 5, 그리고 9일간 배양되었다. 효소 면역 측정법에서, 심장 특정 표지인자 (cardiac troponin T; cTnT, myosin light chain; MLC, myosin heavy chain; MHC, Nkx2.5; NK2 transcription factor related, locus 5, MEF2; Myocyte-specific enhancer factor 2)의 발현은 배양 9일째에 모든 부분에서 높아졌다. PMA를 처리한 중간엽 줄기세포에서 MHC의 발현은 immunocytochemistry를 통해 확인되었다. 알파1A-아드레날린 수용체는 중간엽 줄기세포에 거의 존재하지 않는다고 알려져 있지만, 이를 포함한 알파1- 아드레날린 수용체 하위유형은 PMA를 처리한 중간엽 줄기세포에서 우위적으로 발현되었다. 게다가, 베타-아드레날린 수용체와 무스카린 수용체의 발현도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포와 비교하여 2배 이상 증가하였다. 처리한 중간엽 줄기세포에서 칼슘관련 인자 (SERCA 2a; sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, LTCC; L-type Ca2+ channel)의 mRNA 수준은 심근세포와 유사한 양상을 보였다. 노르에피네프린 (NE)에 의한 비대성 반응에서, 비대성 인자인 ERK1/2의 활성은 PMA를 처리한 중간엽 줄기세포에서 시간 의존적으로 증가되었다. 결론적으로, PKC활성체인 PMA는 중간엽 줄기세포의 심근세포 분화를 유도했다. 이는 단백질 키나아제 조절이 줄기세포의 분화의 선택적 방법이 될 수 있음을 암시한다.

[영문]Under proper stimulation, mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells capable of differentiating into myocytes, chondrocytes, adipocytes, osteoblasts, and tenocytes, both in vivo and in vitro. Despite the promising results of myogenic differentiation induced by 5-azacytidine, the molecular mechanisms underlying myogenic differentiation from MSCs remain poorly understood. To achieve effective regeneration of injured myocardium, it is important to find a more physiological way of improving the in situ myogenic differentiation of MSCs. Protein Kinase C (PKC) is one of the signal transduction components involved in the myogenic differentiation of embryonic stem cells. In this study, we investigated the effect of phorbol myristate acetate (PMA), a PKC activator, on myogenic differentiation of MSCs. To confirm the effect of PMA, 1μM PMA-treated MSCs were grown for each two, five or nine days. In sandwich ELISA, the expression of cardiac-specific markers (cardiac troponin T, myosin light chain, myosin heavy chain, NK2 transcription factor- related, locus 5, Myocyte-specific enhancer factor 2) was elevated at nine days. MHC expression in PMA-treated MSCs was also demonstrated by immunocytochemistry. Though it has been known that few α1A receptors exist in MSCs, α1-adrenergic receptor subtypes were preferentially expressed in PMA-treated MSCs. Moreover, expression of the β-adrenergic and muscarinic receptors was increased 2-fold in PMA-treated MSCs compared to normal MSCs. The mRNA level of Ca2+-related factor (SERCA 2a; sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, LTCC; L-type Ca2+ channel) in treated MSCs was similar to that in cardiomyocytes. In the hypertrophic response to norepinephrine, activation of ERK1/2, a hypertrophic marker, was time-dependently augmented in PMA-treated MSCs. In conclusion, PMA, a PKC activator, might induce the myogenic differentiation of MSCs. This result suggests that regulation of protein kinase could be an alternative method for differentiation of stem cells.