Rodent에서의 핵인 단백질 rPinX1의 기능 분석

Abstract

[한글]이중 나사선과 3’overhang의 단일 가닥구조로 이루어진 사람의 telomere는 염색체 말단 부위에 위치하며, 여러 단백질들과 함께 염색체를 보존하는 역할을 한다. 정상세포의 경우 telomere의 길이가 critical point에 이르면 세포는 더 이상 분열하지 못하고 세포사멸이나 노화에 이르게 된다. 그러나 사람의 불멸의 세포(immortal cell)이나 종양세포에서는 telomerase에 의해 telomere가 일정하게 유지된다. Telomerase는 활성요소인 TERT 단백질과 주형이 되는 RNA TR로 이루어져 있는 ribonucleoprotein 복합체이다.PinX1은 telomere 결합단백질인 TRF1에 결합하는 단백질로서 염색체 8p23에 위치한다. PinX1의 카르복실 만달기에 있는 TID (telomerase inhibitory domain)이 hTERT와 결합하여 telomerase의 활성도를 저해하는 것으로 알려져 있다. 또 PinX1이 과발현된 세포에서는 세포 성장에 영향을 미치면서 telomere 길이감소를 유발하는 것이 관찰되었다. 이와 같이 PinX1이 telomerase 억제자(inhibitor)로서 종양 억제유전자로서의 가능성이 제기되면서 암치료에 대한 이용 가능성이 부각되었다.본 연구실에서는 rodent에서 PinX1기능 규명을 위해 PinX1을 백서의 간줄기세포인 WB-F344에서 클로닝 하였다. 아미노산 331개로 이루어진 rPinX1은 사람과 73%, 쥐와 91%의 유사성을 띄었다. 또 염색체 15p12에 위치하며 핵인 단백질 fibirillarin과 co-localization 하는 것을 확인하였다. 백서 PinX1 전사가 심장, 간과 고환에서 발현하고 있음을 확인하였다. 또 rPinX1의 stable cell line을 제작하여 세포의 성장 및 노화에 미치는 영향과 3’overhang과 telomere 길이의 변화를 살펴보았다. rPinX1 stable cell이 PDL(population doubling) 100이 넘어가면서 세포 모양이 납작하고 커지는 노화 형태를 띄면서 성장이 억제되었고 SA-β-gal assay를 통해 세포의 노화가 확인되었다. Stable cell line은 3’ G-rich overhang 변화는 없었으나 후기 계대에서 telomere 길이 감소를 확인하였다. 대조군 세포주에 비해 stable cell에서 뚜렷한 telomerase 억제효과는 없었으나 PinX1 과발현은 백서에서도 telomere 길이 감소를 이끌었고 짧은 telomere는 궁극적으로 세포 노화를 유도한 것으로 추정된다. 본 연구는 PinX1의 telomere 길이조절 기능이 포유류에서 보존됨을 확인 하였고, 또한 향후 PinX1을 이용한 새로운 항암제 표적 단백질로서의 동물실험의 기초가 될 것이라 기대된다.

[영문]Telomere consists of the double strand and a single stranded 3’overhang. Human telomeres and various telomere binding protein complexes protect the ends of linear chromosomes. In somatic cells, telomeres shorten until they reach a critical length at which they are no longer able to be cell division and induce replicative senescence. However immortalized human cell and tumor cell maintains chromosomal stability by telomerase enzyme that is ribonucleoprotein complex. Telomerase identified as the catalytic subunit TERT and RNA template, TR. PinX1 is TRF1 binding nucleolus protein which locates to human chromosome 8p23. TID (telomerase inhibitory domain) of C-terminal directly inhibits cellular telomerase activity and leads to progressive telomere shortening. PinX1 overexpressed cell line has effect on cell growth which is being correlated with telomere shortening. The depletion of endogenous PinX1 increased telomerase activity. These results suggest that PinX1 is a putative tumor suppressor and might be useful for cancer therapy.In our laboratory rat PinX1 gene was cloned from WB-F344 cell line which encodes a protein of 331 amino acids with 73% similarity to human PinX1 and 91% to mouse. rPinX1 locates to chromosome 15p12 and protein located to nucleolus which was assessed by co-localization with fibrillarin. In this study, northern analysis revealed that rPinX1 mRNA is abundant in heart, liver and testis. To examine the rPinX1 effect on cell and telomere maintenance, we established rPinX1 overexpressed NIH-3T3 cell lines. The growth of rPinX1 stable cells in NIH-3T3 slowed down after 100 population doublings. Cells exhibited increased size and a flattened morphology and they were stained positive for the SA-β-gal assay. We found no detectable 3’ G-rich overhang size and the telomerase inhibition in stable cell. However, the telomere length was progressively altered at the late passage of stable cell. The cellular senescence was induced as result of the shorten telomere. Given its ability to induce crisis, telomere shortening, PinX1 might be a new target of cancer therapy as rodent model.