Adenoviral vector-mediated Glucagon-like peptide 1 gene therapy to normalize glucose levels in type II diabetic models

Abstract

[한글]Incretin 호르몬인 GLP-1은 소장에서 분비하는 인슐린 촉진 호르몬으로서 제2형 당뇨의 새로운 치료약물로 연구 개발 중인 중요한 펩타이드이다. 그러나 Plsma 에서의 짧은 half-life를 가지는 한계를 가지므로 우리는 Adenovirus 를 이용하여 GLP-1을 다량 발현시키는 것을 고안하였고, 그 결과 혈당 및 인슐린 발현에서의 개선 효과를 확인할 수 있었다. 제2형 당뇨 모델인 ZDF rat 과 db/db mouse를 이용하여 in vivo 실험을 하였고, 293 cell 과 INS-1E cell 등을 이용하여 In vitro 실험을 수행하였다.첫째 in vitro 실험에 관한 것이다. GLP-1 plasmid는 강력한 CMV 프로모터에 의해 발현이 유도되고 Insulin leader 를 통해 Media에 분비된다. 이것을 측정하기 위해 우리는 HEK 293 Cell을 이용하여 transfection 을 실시하였고, Media에 분비된 GLP-1은 ELISA 를 통해 확인하였다.이 plasmid에서 insulin leader를 첨가한 이유는 ER막을 통과하여 Golgi body 로 제대로 통과시키기 위한 것이다.이를 확인하기 위하여 Leader가 없는 군과 transfection, northernblot 등의 비교 실험을 수행한 결과 Leader sequenc가 있는 것이 훨씬 더 많은 GLP-1 peptide를 분비한다는 것을 확인할 수 있었다. GLP-1이 Insulin의 분비를 촉진시킨다는 것을 증명하기 위해 INS-1E cell 에 분비된 GLP-1을 투여하여 대조군과 비교실험 하였고 분비된 Insulin은 RIA 를 이용하여 측정한 결과 GLP-1이 Isulin의 분비를 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 이 plasmid를 이용하여 Ad-GLP-1을 제작하였고, 이 plasmid 또한 insulinotropic cell인 INS-lE cell에서 insulin분비를 촉진시키는 것을 측정하였다.둘째 in vivo 실험에 관한 것이다.GLP-1의 cell 상의 테스트를 마친 결과 우리는 Ad-GLP-1 plasmid를 HEK 293 cell에 transfection 하여 Adenovirus를 만들었고 그것으로 제2형 동물모델인 ZDF rat 과 db/db mouse 에 injection 하여 제2형 당뇨 개선 효과를 보았다. 먼저 adenovirus를 동물의 tail vein과 portal vein 에 injection하여 혈당의 변화를 OGTT로 측정한 결과 확연한 혈당개선효과를 볼 수 있었고, blood sampling 후 serum에서의 GLP-1과 insulin 측정에서 대조군과 비교 시 상승하는 것을 확인하였다.마지막으로 adenovirus injection 한 동물의 liver와 pancreas 조직을 적출하여 immunohistochemistry를 실시하여 GLP-1과 insulin의 조직에서의 발현정도를 알아보았다. 그 결과 Liver에서 GLP-1이 발현되는 것을 확인하였고, Pancreas에서 insulin이 발현되는 것을 immunostain을 통해 확인할 수 있었다.결과적으로 이러한 실험 연구들을 통해 Adenovirus에 의한 GLP-1 유전자 치료를 성공적으로 할 수있었고, 이전 연구들의 한계인 Plasma 에서의 GLP-1 half-life 를 GLP-1 대량 발현을 통해 극복할 수 있었다. Adenovirus 를 이용한 GLP-1 gene therapy 는 좀 더 안정적으로 발현시키며 그 결과 혈당에서의 개선과 인슐린 분비촉진의 효과를 볼 수있었고 그에 따라 제2형 당뇨의 치료에 밝은 미래를 제시할 수 있다.

[영문]BackgroundGlucagon-like peptide-1 (GLP-1) is an intestinally derived insulinotropic hormone currently under investigation for use as a novel therapeutic agent in the treatment of type 2 diabetes. However, the short plasma half-life of the active forms of GLP-1 poses an obstacle to the sustained delivery of this peptide. In this study, we developed the mass expression system of GLP-1 peptides using Adenovirus and also evaluated the effect of GLP-1 gene delivery both in vitro and in vivo.MethodsIn vitro, we constucted the plasmid that expressed GLP-1(7-37) , pAAV-ILGLP-1. The nucleotide sequence encoding the signal peptide from human insulin leader (IL sequence) required for secretion of GLP-1 and it is driven by a potent Cytomegalovirus promoter. We proved the promoted level of the GLP-1 secretion comparing with other control plasmids, pAAV-MCS(vector alone) and pAAV-GLP-1(none insulin leader). GLP-1 peptides which secreted in media were evaluated by ELISA(Linco research) and the mRNA level measured by Northern blot in 48h after transfection in HEK(human embryonic kidney) 293 cell. Coculture assay for evaluation the insulinotropic effect of the GLP-1(7-37) peptide was performed with INS-1E cell, the rat insulin producing beta cell line, and plasmidtransfected HEK 293 cell.In vivo, we constructed the ILGLP-1 expressed Adenoviral plasmid. The ILGLP-1 sequences are inserted in pShuttle vector and pShuttle-ILGLP-1 linked pADEasy(Adenoviral vector) and we constructed pAD-LacZ, the control vector(Not containing the ILGLP-1 sequence) . We injected the GLP-1 expressed Adenovirus and LacZ virus(empty virus) via tail vein or portal vein in the Zucker Diabetic Fatty rat, type 2 diabetes animal model, and checked the blood glucose level by oral glucose tolerance test(OGTT), the plasma insulin and GLP-1 by radioimmunoassay(RIA). Finally we demonstrated the expressed GLP-1 peptides in Liver tissue by immunohistochemistry.ResultsThe in vitro results showed that GLP-1 secretion into media more effectly through insulin leader sequence. In vivo study, we resulted in improving blood glucose level and it was maintained for three weeks. The plasma GLP-1 and insulin concentration was increasing in early stage. Finally we proved the increasing GLP-1 expression in Liver and more expressed insulin in pancreas.ConclusionThese results demonstrate that our Adenovirus-mediated in vivo GLP-1 gene therapy providesalthough the short half-life and thus more effective blood glycemic control. This GLP-1 gene delivery system may provide an effective and safe treatment modality for type 2 diabetes.