독일바퀴 주 알레르겐 Bla g 2의 peptide 단편에 대한 IgE 반응

Abstract

[한글]바퀴는 천식이나 여러 가지 호흡기 알레르기 질환을 일으킨다. 바퀴알레르겐 중 Bla g 2는 가장 중요한 알레르겐으로 알려졌다.Bla g 2가 바퀴알레르기를 유발하는데 매우 중요한 요소임에도 불구하고, Bla g 2의 대한 B cell epitope과 T cell epitope에 대한 연구는 아직 이루어 지지 않았다. 따라서 본 논문에서는 재조합 단백질 이용하여 B cell과 결합하는 Bla g 2의 IgE binding epitope의 위치를 알아보고자 하였다.독일바퀴의 성충으로부터 RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 이용해 Bla g 2 유전자를 클로닝하여 기존의 Bla g 2 DNA서열 (U28863)과 비교하였다. 그 결과, 11개의 클론 중 10개의 클론이 다음과 같은 4개의 아미노산 서열이 치환되어 있었고 : amino acid position 87 (K → R), 116 (S → F), 142 (V → G), 322 (T → A), 1개의 클론은 다음과 같은 5개의 아미노산 서열이 치환되어 있었다 : amino acid position 87 (K → R), 116 (S → F), 142 (V → G), 199 (Y → C), 322 (T → A).E. coli에서 발현한 rBla g 2와 Pichia pastoris에서 발현한 PrBla g 2 (INDOOR biotechnologies Inc, Manchester, U.K)에 대한 IgE 반응성을 비교하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 세브란스 병원의 알레르기 클리닉을 찾은 바퀴알레르기 환자 38명의 혈청을 연구에 이용하였다. 그 결과 총 38명의 환자들 중 17명이 PrBla g 2와 rBla g 2에 반응한 것을 알 수 있었으며, 2명은 PrBla g 2에 강하게 반응하였다.클로닝한 Bla g 2를 5개의 단편으로 나누어 발현하고 재조합 단백질을 생산하였다. rBla g 2와 PrBla g 2에 강하게 반응한 환자 중 10명의 환자를 선별하여 rBla g 2 단편의 재조합단백질에 대한 IgE 결합능을 ELISA를 통해 알아보았다. 그 결과 바퀴알레르기환자 혈청 10명 모두에서 rBla g 2에 반응을 보였으며, 단편A는 8명 (80%), 단편B는 5명 (50%), 단편C는 10명 (100%), 단편D는 3명 (30%), 단편E는 4명 (40%)로, 나타났다. 따라서 모든 단편에 IgE binding 서열이 존재하나 특히 아미노산 1～75와 146～225 서열이 IgE-binding에 중요한 서열을 포함하고 있음을 알 수 있었다.재조합 알레르겐을 이용한 Bla g 2의 linear B cell epitope에 대한 연구는 정확한 진단과 면역치료를 위한 기초자료로 활용될 것이다.

[영문]The aim of this study was to identify linear IgE-binding epitopes of Bla g 2. The cDNA encoding Bla g 2 was cloned by RT-PCR and its recombinant protein was expressed. Eleven Bla g 2 cDNA clones were sequenced and analysed, and amino acid sequences were compared with a previously reported Bla g 2 sequence (U28863). Ten clones were substituted at 4 amino acid positions : position 87 (K to R), 116 (S to F), 142 (V to G), 322 (T to A). Only one clone was substituted at 5 amino acid positions : position 87 (K to R), 116 (S to F), 142 (V to G), 199 (Y to C), 322 (T to A). The reactivities of commercial Pichia expressed recombinant protein (PrBla g 2) and E. coli expressed recombinant protein (rBla g 2) were evaluated in an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) using sera from 38 cockroach allergic patients. The sera of 17 patients reacted with rBla g 2 and PrBla g 2, and two patients showed high IgE reactivity to PrBla g 2. Five cDNA fragments were generated by PCR and their recombinant proteins were expressed and purified. IgE-binding reactivity of recombinant fragments were determined by ELISA with sera from 10 patients who showed high IgE reactivity both to the rBla g 2 and PrBla g 2. All 10 patients (100%) showed IgE reactivity to the Bla g 2 full-length and fragment C (amino acid sequence 146～225), 8 patients (80%) reacted with fragment A (amino acid sequence 1～75). These result indicated that the major linear IgE-binding epitopes may be located within the amino acid sequence 1～75 and 146～225 of Bla g 2. Analysis of IgE epitopes provide the basis for the development of safe forms of specific immunotherapy with reduced allergenic molecules.