Comparison of time course gene expression patterns in developing mouse mandible during E10.5 to E16.5 : analysis of real-time quantitative PCR by using the 2-ΔΔCT method

Abstract

[한글]치아발생에 관여하는 유전자는 약 300개정도인 것으로 보고되었다. 생쥐의 치아발생 단계인 개시기 (E10.5), 싹시기 (E12-13), 모자시기 (E14.5), 그리고 종시기(E16.5)에서 상피세포와 간엽세포간 신호전달은 치아발생을 유도하는 핵심적인 역할을 하며, 그들 사이에서 특정 유전자의 발생단계별 발현율의 변화는 치아의 발육과 형태, 그리고 크기 등을 결정하는 요소인 것으로 알려져 있다. 유전자의 발현율을 발생단계별로 정량적으로 측정하여 시간에 따른 발현 변화를 상대적으로 비교하며 살펴보는 방법은 유전자의 상호관계를 이해하는데 있어 유용하게 활용될 수 있으며, 또한 유전자의 시계열 패턴은 주요 유전자의 기능적인 연관성과 상호작용을 추정하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 이번 연구에서는 E10.5부터 E16.5시기의 생쥐 배아로부터 전치와 구치 치배, 그리고 치극을 하악턱 발생 부위로부터 추출하여 치아발생에 있어 주요하게 관여하는 것으로 알려진 12개의 유전자 Fgf8, Bmp4, Lhx6, Pax9, Barx1, Msx1, Msx2, Shh, Ptc (Ptch1), Gli3, Lef1, Activin (Inhba)의 발현패턴을 연구하였다. 실시간중합효소연쇄반응(real-time quantitative polymerase chain reaction; RT-qPCR) 실험을 통해 얻은 발생단계별 정량적 발현양의 데이터를 2^-ddCT 방법을 응용하여 유전자간 상대비교 방법으로 정규화하였으며, cDNA와 시발체 (primer)의 결합에 관한 자유에너지로부터 실시간중합효소연쇄반응의 증폭에 관한 효율을 추정하였고, 2^-ddCT 방법에 효율을 적용하여 보정하였다. 분석에 필요한 계산과 시계열패턴의 그래프는 직접 개발한 CHStat (version 1.1.5.0) 프로그램으로 분석하였다. 치아발생에 관여하는 주요 유전자 12개의 시간에 따른 패턴의 변화와 상관관계를 기존에 보고된 유전자의 기능과 실험에 대해 비교분석한 결과는 실시간중합효소 연쇄반응실험을 이용하여 시계열데이터를 분석하는데 있어 2^-ddCT 방법은 데이터를 정규화하는데 유용하게 활용될 수 있으며, 치아발생에 관여하는 유전자의 시계열 발현패턴은 치아의 발생시기별 유전자간 상호관계를 연구하는데 유용하게 활용될 수 있음을 보여주었다.

[영문]Gene interactions in tooth germ at each embryonic stage have been main focus to understand tooth development. To observe the meaningful 12 genes’ time-course patterns, Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) experiments were designed regarding Fgf8, Bmp4, Lhx6, Pax9, Barx1, Msx1, Msx2, Shh, Ptc (Ptch1), Gli3, Lef1, and Activin (Inhba). The incisor and molar tooth germ and diastema between them were dissected out from ICR mouse by stages at E10.5, E13.5, E14.5, and E16.5 respectively. The time-course patterns have been predicted by using the 2^-ddCT method based on the normalization of gene expression levels comparing with an internal control gene such as GAPDH, and the patterns showed negative or positive relationship. The amplification efficiency during RT-qPCR was estimated by the thermodynamic minimum free energy of binding between a cDNA and a primer. The 2^-ddCT method with RT-qPCR experiments was useful method for analysis to predict the time-course gene expression patterns. The meaningful 12 genes’ time-course patterns are able to serve as a worthwhile guideline for the research of gene interactions in tooth development.