제4기 신경모세포종에서 tyrosine hydroxylase mRNA RT-PCR을 이용한 미세잔존암 검출의 임상적 의의

Abstract

[영문]

[한글]

신경모세포종은 소아에서 비교적 흔하게 발생하는 고형종양으로서 수술, 항암제 투여

및 방사선치료의 병합으로 치료율이 많이 향상되었으나 이러한 치료방법의 발달에도 불구

하고 제4기 신경모세포종은 3년 생존율이 10-15%에 불과하다. 최근에는 이러한 낮은 생존

율을 개선하기 위하여 고용량의 항암제 투여 후 말초조혈모세포를 이식하는 방법이 도입

되어 그 생존율이 30-40%까지 향상되었으나 아직 만족할 만한 성과를 얻지 못하였으며,

이식 후의 놓은 재발율을 낮추는 것이 해결되어야할 가장 큰 과제로 남아있다. 재발은 주

로 수집된 조혈모세포군에 포함된 암세포가 다시 주입됨으로서 일어난다는 것이 과거 여

러 연구에서 실험적으로 입증되었고, 이런 암세포의 오염을 줄이는 방법중의 하나로 CD34

표지자를 이용한 조혈모세포의 선택적 분리가 개발되어 시도되고있다. 저자는 신경모세

포종의 세포에서 민감한 양성반응을 보이는 것으로 알려진 tyrosine hydroxylase mRNA의

역전사효소 중합효소연쇄반응(이하 THMR-RT-PCR)으로 신경모세포종 세포의 오염여부를 확

인하고자 하였고, CD34양성세포의 선택적 분리가 암세포 오염 방지에 기여하는 정도를 환

자의 경과와 함께 알아보고자 하였다.

제4기 신경모세포종으로 진단 받은 8명의 환아(남아: 5예, 여아: 3예, 정중 연령 5년 5

개월)를 대상으로 하였는데 이 들에서 채취한 검체는 1) 진단 당시의 골수혈, 2) 3차례의

항암제 투여 후 시행한 골수혈, 3) 항암제와 G-CSF 투여 후 수집한 말초혈액조혈모세포

군, 4) CD34 양성세포를 선택적으로 분리 수집한 말초혈액조혈모세포군 이었다.

8예 중 세포도말 검사상 골수의 침범이 없었던 1예는 치료 전 골수의 THMR-RT-PCR 검사

상 음성이었고, 세포도말 검사상 암세포를 볼 수 있었던 7예 중 치료 전 골수에서 THMR-R

T-PCR검사가 가능한 3예 모두에서 이 검사가 양성으로 반응하여 THMR-RT-PCR 검사가 신경

모세포종 세포를 비교적 예민하게 검출할 수 있는 방법으로 사료되며, 3차례의 항암제 투

여 후 시행한 골수 세포도말검사상 8예 모두에서 암세포를 볼 수 없었는데 THMR-RT-PCR

검사가 가능하였던 6예 중 5예는 THMR-RT-PCR 검사상 음성이었으나 나머지 1예는 이 검사

상 양성으로 반응하여 골수 세포도말검사상 암세포가 보이지 않더라도 신경모세포종 세포

의 오염 여부를 확인하기 위해 THMR-RT-PCR을 이용한 검사가 필요할 것으로 사료되는바,

이를 바탕으로 보다 정확한 병기 결정, 치료 반응 평가, 조혈모세포이식 시기 결정 및 재

발의 조기발견에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

항암제 투여 후 임상소견 및 골수의 세포도말 검사상 완전 관해였으며,골수혈에 대한 T

HMR-RT-PCR의 검사 결과도 음성이었던 5예 중 1예는 항암제와 G-CSF를 투여(가동화:mobil

ization)한 후 말초 조혈모세포에서 THMR-RT-PCR검사가 양성으로 반응하여 가동화 중 압

세포가 출현할 수 있는 것으로 사료된다.

가동화한 후 수집한 말초 조혈모세포의 THMR-RT-PCR 검사상 3예가 양성이었는데, 이 중

1예는 CD34 양성세포 선택과정을 거친 후 THMR-RT-PCR 검사상 음성으로 역전되었으나, 1

예는 CD34 양성세포의 선택적 분리 후에도 지속적으로 양성이었고, CD34 양성세포분리 전

말초 조혈모세포의 THMR-RT-PCR 검사상 음성이었던 5예 중 2예는 CD34 양성세포 분리 후

양성으로 반응하여 CD34양성세포의 선택적 분리의 효용성을 평가하기 위해서는 좀 더 많

은 예를 대상으로 한 연구가 시행되어야 할 것으로 생각된다.

고용량의 항암제투여 및 조혈모세포이식을 시행한 7예에서 모두 백혈구 및 혈소판이 성

공적으로 생착되었으나 3예에서 재발하였고, 이중 2예는 CD34 양성세포의 선택적 분리 후

THMH-RT-PCR 검사상 음성이었음에도 불구하고 재발로 인해 사망하였던 바, 이식되는 말

초 조혈모세포군내 신경모세포종 세포의 오염이 없어도 다른 경로를 통하여 재발 될 가능

성을 고려할 수 있을 것으로 사료되며, 또한 관찰 기간 동안 재발의 증거 없이 생존하고

있는 4예 중 2예는 CD34 양성세포의 선택적 분리 후 THMR-RT-PCR 검사상 양성이어서 이식

된 말초 조혈모세포군내 신경모세포종 세포의 오염으로 인한 재발의 가능성이 있으므로

지속적으로 주의 깊은 추적관찰이 필요할 것으로 사료된다.

Clinical Significance of Minimal residual disease detection using tyrosine

hyaroxylase nRHA RT PCR in patients with stage IV neuroblagtoma

Song-Hee Park

Department of Mediine The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Baek-Keun Lim)

A sensitive assay was developed for the detection of neuroblastoma cell

contamination in CD34+ selected and unseparated peripheral blood stem cells(PBSC)

used for autologous transplantation in stage 4 neuroblastoma patients, Ever since

detection systems have been improved, neuroblastoma cells have also been found in

PBSC preparations by immunocytological method and by immunocytology and clonogenic

analysis used in combination. To overcome tumor cell contamination, CD34+ selection

has been proposed as a purging method. Specifically we used a non-radioactive

nested CDNA-RT PCR(nPCR) for detection of tyrosine hydroxylase(TH) gene expression.

We monitored the efficiency of tumor cell purging following CD34 selection in PBSCS

from 8 patients with advanced neuroblastoma. Eight patients with stage IV

neuroblastoma were included in this study. Before mobilization of PBSC, patients

were treated with chemotherapy, operation and radiotherapy. CD34+ progenitor tcells

were enriched from at least 1x10**6/kg using the Ceprate SC system cell

concentrator(CellPro, Bothell, WA), Total RNA was extracted using RNA isolation kit

from bone marrow and PBSC. This RNA were reverse transcribed using Superscrip

reverse transcriptase. After then nested PCR was performed wi th tyrosine

hydroxylase speci hic primers from econ 5 and 8. Pretreatment bone marrow analysis

by this method were possible in 4 patients. 3 of these patients were positive for

TH mRNA. Bon emarrow sample from 1 patient wi trout cytological bone marrow

involvement was negative for TH mRNA. After chemotherapy, bone marrow analysis from

5 patients who had no cytological bone marrow involvement were negative for TH

mRNA. But bone marrow from 1 patient who had no cytological bone marrow involvement

was posi five for TH mRNA. So TH mRNA RT PCR should be necessary for evaluation of

cl inical remission in no cytological marrow involvement cases. Since RT-PCR for TH

mRNA was sensitive method to detect minimal residual neuroblastoma col Is, this

method can be used to evaluate initial disease status, response to treatment , time

to collect stem cert Is for transplantation and to detect relapse early Before the

CD34 posi tive cert 1 selection, various number of contaminating eel Is were found

in leukapheresis of 3 patients. After positive selection, neuroblastoma cells were

detectable in 3 patients. In one patient, PCR positive PBSCS became PCR negative

after selection. In 7 of the 8 patients, high dose chemoradiotherapy was performed.

In all these 7 patients, median time to reach >0. 5x10**6/L granulocyte was 11

days(range 11-16). 3 patients were relapsed after PBSC infusion and 2 patients died

due to relapse. 4 patients have been survived without relapse. We suggest that

tumor col 1 contamination may be frequently detected in PBSC harvests of stage IV

neuroblastoma patients by sensitive molecular analysis. The load of contaminating

malignant cells might be reduced following CD34 posi tive selection. However

strategies to improve the recovery of the CD34+ cells and purging efficacy of this

method should be evaluated further.