백서 간장의 cDNA library로부터 분리한 ATP-citrate lyase cDNA의 subcloning과 restriction map 결정

Abstract

[영문]

[한글]

ATP-citrate lyase(EC 4.1.3.8, ACL)는 ATP 존재하에 citrate와 coenzyme A(CoA)가 반

응하여 oxaloacetate와 acetyl CoA를 생성하는 반응을 촉매하여 세포질에서 지방산 및 ch

olesterol 생합성에 필요한 acetyl CoA를 공급하는 효소로서 동물 조직의 세포질에 존재

하며 분자량 약 110kDa인 4개의 동일한 소단위로 구성되어 있다.

이 효소는 인산화와 탈인산화에 의해 단기조절되며 hormone과 식이조성에 따라 장기조

절된다고 보고되어 있으나 각 조절 단계인 효소의 활성도 및 효소의 양, 세포질 내 mRNA

의 조절 및 이 효소를 합성하는 유전자의 전사 활성도 등 상호관계가 정확하게 밝혀져 있

지 않다. 또한 이러한 효소 조절의 정확한 기전을 밝히기 위해서는 이 효소의 유전자가 c

loning되고 염기 서열이 결정되어야 하나 아직까지 이 효소의 조절기전을 밝히기에 충분

한 ACL에 대한 cDNA의 cloning이 보고되지 못하였고, cDNA의 크기와 1차 구조인 restrict

ion map 및 염기 서열에 대한 연구가 전혀 되어있지 않다.

이에 본 연구에서는 ACL의 유전자 크기와 염기 서열을 밝히기 위하여 그 첫단계로 Agtl

l expression vector를 사용하여 제조한 백서 간장의 cDNA library로부터 분리한 25가지

의 AACL clone(Lee, 1989a)으로부터 생성되는 fusion 단백질을 분석하여 각 clone이 생성

하는 fusion 단백질과 삽입된 cDNA의 상호 관계를 비교하였으며 각 cDNA를 DNA 조작과 분

리가 phage DNA보다 용이한 plasmid vector인 pGEM-4Z에 subcloning하고 이 subcloning된

cDNA의 restriction map을 결정하였다.

25가지의 AACL clone으로부터 분리한 phage DNA를 EcoRI 제한효소로 처리한 후 전기영

동을 시행하여 14가지의 clone에서 cDNA insert를 확인하였다. Insert가 확인된 14가지의

clone중 6가지 (AACL1, AAcL3, AACL5, AACL9, AACL123, AACL25) clone과 cDNA가 삽입되

어 있지 않은 Agtll phage DNA의 lysogen으로부터 세포 균등액을 준비한 후 ACL에 대한

항체를 사용하여 immunoblot 분석으로 각 AACL lysogen에서 생성된 fusion 단백질을 분석

한 결과, AACL3, AACL5, AACL9와 AACL123에서는 각각 분자량 118kDa, 140kDa, 135kDa, 11

9kDa 크기의 뚜렷한 단백질대가 ACL에 대한 항체와 반응하여 나타났고 AACL25는 120kDa

크기의 매우 희미한 단백질대가 나타났다. 그러나 AACL1은 cDNA가 삽입되어 있음에도 ACL

에 대한 항체와 반응하는 단백질대가 나타나지 않았다.

ACL에 대한 CDNA가 삽입되어 있는 14가지의 clone중 AACL1의 0.7 kilo base pair (kbp)

, AACL3의 1.0kbp와 0.5kbp, AACL의 1.0kbp와 0.5kbp, AACL5의 0.65kbp, AACL8의 1.0kbp,

AACL9의 0.73kbp, AACL15의 1.3kbp와 1.0kbp, AACL17의 1.2kbp, AACL23의 0.9kbp, AACL2

5의 3.0kbp 크기의 cDNA를 분리하여 plasmid vector인 pPEM-4Z에 subcloning을 시행하였

으며 각 subcloning된 plasmid를 EcoRI 제한효소로 처리한 후 agarose gel 전기영동을 시

행하여 subcloning된 cDNA를 확인하였다.

이들 가운데 immunoblot 분석으로 ACL에 대한 항체와 뚜렷한 양성반응을 보인 AACL5와

AACL9의 subclone인 pGACL5 및 pGACL9C에 삽입된 cDNA로부터 nick translation 방법으로

**32P로 label된 probe를 각기 제조하고 이를 사용하여 subcloning된 10가지의 plasmid가

Southern blot된 nitrocellulose(NC) membrane과 hybridization을 시행하여 각 cDNA간에

hybridization 반응이 일어나는지를 확인한 결과, pGACL5 probe는 pGACL5의 cDNA, pGACL

9C probe는 pGACL9C의 cDNA와만 강하게 반응하였으며 다른 cDNA insert와는 hybridizatio

n 반응이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 미루어 이 두 cDNA insert는 서로 다른 별개의

cDNA이며 다른 cDNA와는 overlapping되는 부위가 없는 것을 확인하였다.

pGACL5와 pGACL9 plasmid를 EcoRI, BamHI, HindIII, KpnI, PstI, SacI 등의 제한효소로

처리한 후 agarose gel 전기영동을 시행하여 나타나는 DNA fragment를 분석하여 pGACL5

와 pGACL9의 restriction map을 결정하였다. 그 결과, pGACL5의 경우 0.65kbp 크기의 cDN

A가 pGEM-4Z vector의 EcoRI 제한효소 절단부위에 삽입되어 있었으며 이 cDNA 내에는 Eco

RI, BamHI, HindIII, KpnI, PstI, SacI 등의 제한효소로 절단되는 염기서열 부위가 존재

하지 않았으며, pGACL9C의 경우 약 0.7kbp 크기의 cDAN가 pGEM-4Z vector의 EcoRI 제한효

소 절단부위에 삽입되어 있었으며 이 cDNA 내에는 HindIII와 SacI으로 제한 절단되는 염

기서열 부위가 각각 하나씩 존재하며 그 위치는 pGEM-4Z plasmid 내의 ampicillin 내성유

전자 쪽의 EcoRI 절단 부위로부터 각각 0.12kbp와 0.14kbp 떨어진 위치에 존재하고 있었

다.

Subcloning and Determination of Restriction Map of ATP-Citrate Lyase cDNA from Rat

Liver cDNA Library

Sahng Wook Park

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Yoon Soo Kim, M.D.,Ph.D.)

ATP-cirtate lyase (EC 4.13.8, ACL) catalyzes the reaction producing acetyl Coa

and oxaloacetate from citrate, which is transported from mitochondria. The produced

acetyl Coa is responsible for de nove fatty acid and cholesterol biosynthesis in

the cytosol of animal cells.

ACL is known to be under short-term control by phosphorylation or

dephosphorylation, and long-term control by hormones or didets.

In this study, ACL cDNA- of AACL clones from rat liver cDNA library were

subcloned into pGEM-4Z plasmid vector. And the restriction maps of cDNA from pGACL5

and pGACL9C were determined to elucidate the primary structures of ACL cDNA.

Fourteen of the 25 AACL clones (Lee, 1989a) were shown to have the cDNA insert by

agarose gel electrophoresis. Six AACL clones (AACL1, AACL3, AACL5, AACL9, AACL23,

and AACL25) among the 14 positive clones, and Agt11 phage DNA as a control, were

isolated and analyzed for the fusion protein by immunoblotting with IgG against

ACL. The fusion proteins from AACL3, AACL5, AACL9, AACL23, and AACL25, which

reacted with IgG against ACL, had molecular weights of 118, 140, 136, 119 and

120kDa, respectively.

However, AACL1 and agtll didn't show any reactive fusion protein with IgG against

ACL.

Ten out of 14 positive clones having cDNA inserts were subcloned into pGEM-4Z

plasmid vector. These subcloned cDNA were then analyzed by Southem blot

hybridization technique, using the nick translated **32P-labeled probe prepared

from pGACL5 and pGACL9C, pGACL5 and pGACL9C, which were positive in the immunoblot

analysis, hybridized only with respective probes, indicating that these cDNA encode

different parts of ACL.

The restriction maps for pGACL5 and pGACL9C were detennined. pGACL5 has a 0.65

kilo-base pair (kbp) cDNA insert in EcoRI restriction site of pGEM-4Z and no

nternal restriction sites were identified for the enzymes tested (EcoRI, BamHI,

HindIII, KpnI, PstI, and SacI). pGACL9C has a 0.73kbp cDNA insert in EcoRI

restriction site of pGEM-4Z, and HindIII and SacI restriction sites were identified

in cDNA. No other restriction sites were identified. The position of HindIII and

SacI sites in pGACL9C cDNA were 0.12 and 0.14kbp, respectively, from the EcoRI

restriction site of pGEM-4Z (clock wise direction from the ampicillin resistant

gene in pGEM-4Z vector).