Survivin small hairpin RNA 와 TRAIL 을 발현하는 종양살상 아데노바이러스의 췌장암 세포주에 대한 항 종양 효과와 gemcitabine 내성에 미치는 영향

Abstract

악성 종양인 췌장암은 현재 시행되고 있는 암 치료 법인 수술, 항암제, 방사선 등으로도 치료가 어렵고 예후 또한 좋지 않다. 췌장암에서 수술이 어려운 경우 또는 수술 후 치료법으로 적용되는 방법으로 gemcitabine 이라는 항암제를 이용하는데, 실제로는 항암효과가 5.4% 밖에 나타나지 않고 있는 실정이다. 따라서 새로운 치료 방법을 모색하거나 치료 기전의 내성을 극복하는 방법이 필요하다.악성 종양의 일부에서는 세포고사 신호에 결함이 있는 것이 특징이다. 또한 세포고사 기전의 장애는 종양의 발생과 진행에 중요한 역할을 한다. 따라서 정상 세포에서와는 다르게 조절되는 암세포의 세포생존 조절 단백질을 밝혀내어 그 발현량을 감소시키는 것은 의미가 있다고 할 수 있다. Gemcitabine 처리 시에도 이러한 세포 생존 조절 단백질의 양이 증가하는데, 따라서 이 논문에서는 gemcitabine 처리 시 증가하는 단백질 중 하나이자 세포생존 조절 유전자인 survivin의 발현을 억제하여 gemcitabine에 대한 내성을 극복하고자 하였다. 한편 gemcitabine을 처리할 시에 TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)의 receptor인 DR5가 증가한다는 연구 보고에 의거하여 gemcitabine 처리로 인해 DR5가 증가된 상황에서 TRAIL을 과발현되게 하여서 암세포의 사멸이 보다 활발하게 일어나도록 하였다. 이러한 내용을 바탕으로 본 연구에서는 췌장암 세포에서 gemcitabine처리 시 발현량이 증가하며 세포고사를 억제하는 survivin을 억제시킬 수 있는 siRNA의 전구체인 small hairpin RNA (shRNA)를 제작하여 암세포 내에서의 survivin의 발현량을 억제 함으로써 항 종양 효과가

나타나도록 하였으며, gemcitabine 처리 시 DR5발현량이 증가하는 사실을 이용하여 TRAIL을 함께 삽입하여 세포살상 효과가 증대될 수 있도록 하였다. 이러한 survivin shRNA와 TRAIL 유전자를 암세포로 안정적이고 효과적으로 전달해줄 수 있는 전달체로는 아데노바이러스를 이용하였다. 이 아데노바이러스는 단순히 shRNA를 전달하는 역할뿐만 아니라 암세포에서 선택적으로 증식하고 또한 암세포를 선택적으로 살상하는 특성을 갖도록 제작하여 바이러스 자체로 항암효과를 가지게 하였다.제작된 아데노바이러스로 real-time PCR과 western blot을 진행한 결과 대조군에 비해 survivin의 발현량이 감소되고 TRAIL의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 survivin과 TRAIL의 발현량의 변화가 gemcitabine의 내성을 극복할 수 있는지 알아보기 위해서 MTT assay를 진행하였다. Gemcitabine만 단독으로 처리한 그룹은 아무것도 처리하지 않은 그룹에 비해서 20% 전후의 암세포만 죽은 것으로 나타났지만, survivin을 감소 시켰을 때에는 viablity가 40% 미만으로 내려가고, gemcitabine, TRAIL을 함께 처리했을 때에는 viability가 20% 미만까지 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로는 내성 극복의 이유가 세포고사의 증가 때문이라는 것을 확인하는 실험을 진행하였다. Gemcitabine에 shsurvivin, TRAIL을 처리하였을 때 intrinsic, extrinsic 세포고사의 지표인 caspase 8,9의 활성을 western blot을 통해 알아본 결과 caspase의 활성이 gemcitabine을 단독으로 처리했을 때 보다 눈에 띄게 증가하는 모습을 볼 수 있었다. 또 한가지 실험으로 PI & Annexin V costaining을 진행하여 FACS로 analysis 하였는데,

세포가 죽는 방식이 세포괴사 보다는 초기 또는 후기 세포고사인 것으로 나타났다. 마지막으로 마우스에게 췌장암 종양을 이식한 뒤 제작한 아데노바이러스를 주사하는 방식으로 동물실험을 진행하였다. 그 결과 shsurvivin과 TRAIL이 삽입된 아데노바이러스를 gemcitabine과 함께 주사한 쥐의 그룹이 대조군의 그룹과 비교했을 때 종양의 크기가 감소되고, 마우스가 더 오래 생존한다는 사실을 확인할 수 있었다.