TGF-β1의 발현을 억제하는 종양살상 아데노바이러스의 항 종양 효과

Abstract

암은 체내에서 면역세포를 피해 증식해 나가기 위하여 다양한 종류의 싸이토카인을 분비한다. 그 중에서 TGF-β1은 정상세포와 암세포에서 상반되는 역할로 주목받고 있다. TGF-β1은 정상세포에서 발현될 때에는 세포의 성장을 억제하는 물질이지만 암세포에서는 면역회피를 유도함으로 암의 진행을 돕는다고 알려져 있다. TGF-β1은 암세포에서의 역할이 변화한 것뿐만 아니라 과발현함으로 암세포가 효과적으로 면역세포를 피해 성장할 수 있도록 한다. 따라서 본 연구는 TGF-β1의 발현 억제시 항 종양 효과에 미치는 영향을 규명하고자 계획 하였고 TGF-β1의 발현을 억제하는 방법으로 shRNA를 탑재한 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 이용하였다.RNA interference는 짧은 가닥의 RNA가 상보적으로 결합하는 mRNA를 분해시킴으로 그 mRNA의 발현을 억제하는 현상을 나타낸다. 이러한 현상은 체내로 유입된 shRNA가 Dicer에 의해 siRNA가 되고 RISC와 결합하여 mRNA를 분해하는 방식으로 일어난다. 이러한 기작을 바탕으로 TGF-β1의 발현을 억제하기 위해서 shRNA을 제작하여 아데노바이러스에 삽입하여 이용하였다.암 유전자 치료 연구의 초기에는 증식불능 아데노바이러스를 주로 이용하였으나 감염된 세포에서만 치료 유전자가 발현되기 때문에 그 효과가 제한적이고 일시적이어서 지속적인 효과를 보기에 미흡하다는 단점이 있었다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위하여 본 연구에서는 암 세포에서만 복제가능한 바이러스를 이용하여 효과적인 암세포 특이적 살상효과를 얻고자 하였다. 이러한 배경하에 본 연구에서는 survivin의 발현양이 높은 암세포에서 특이적으로 복제 가능한 아데노바이러스에 shTGF-β1 염기서열을 삽입하여 아데노바이러스 자체에 의한 항 세포살상 효과뿐만 아니라 암세포내에서 면역회피를 유도하는 TGF-β1의 발현을 억제하여 종양세포에 대한 숙주의 면역반응을 증강시키고자 하였다. 하지만 아데노바이러스는 사람을 숙주로 하는 바이러스이기 때문에 마우스 세포에 감염이 잘 되지 않는 단점이 있다. 따라서 사람의 암세포를 마우스에 이식하여 암세포가 마우스의 면역반응에 의해 소멸되지 않도록 마우스에 면역억제제를 일정기간 처리한 후 실험을 진행하였다. 실험결과는 다음과 같다. 먼저 shRNA에 의한 TGF-β1 mRNA의 감소여부를 real-time PCR로 확인해 본 결과 TGF-β1의 mRNA양이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 TGF-β1의 단백질 역시 mRNA의 결과와 비례하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 TGF-β1을 억제하는 효과가 검증된 shRNA를 증식 가능한 아데노바이러스에 삽입하였다. 이후 재조합 아데노바이러스의 종양선택적 살상능을 확인하기 위한 in vitro 실험에서 TGF-β1이 감소됨에 따라 세포 살상능이 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, 제작된 종양선택적 살상 및 증식 가능 TGF-β1을 감소시키는 shRNA를 발현하는 아데노바이러스는 동물실험에서 바이러스 감염 초기에는 항 종양 효과가 있었지만 점차 종양이 감소하는 효과가 줄어드는 것을 관찰하였다. 하지만 이러한 결과는 조직면역화학염색를 통하여 그 효과가 약화되는 것이 아니라 실제는 종양이 사라진 자리에 면역세포가 침윤되어있는 결과라는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 더욱 효과적으로 검증하기 위해서는 새로운 동물모델을 구축해야 할 것으로 생각되며 in vitro 에서 TGF-β1의 발현을 억제할 경우 시간이 지날수록 TGF-β3의 발현이 증가한 것으로 미루어 보아 새로운 동물모델을 사용할 경우 TGF-β3를 TGF-β1과 함께 억제할 경우 항 종양효과가 더 증가될 것이라고 생각한다.