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The effect of MZF-1 phosphorylation by PKCK2 on cancer cells

Other Titles
 암 세포에서 PKCK2에 의한 MZF-1 인산화의 효과 
Issue Date
Dept. of Medical Science/석사
The epithelial mesenchymal transition (EMT) is an important phenomenon during metastasis of cancer cells. When EMT occurs, E- to N- cadherin switching is a prerequisite. Protein kinase casein kinase 2 (PKCK2) is messenger-independent serine/threonine protein kinase and involved in apoptosis, cell survival, Wnt signaling pathway, DNA repair, and cell cycle. Recently, it is reported that PKCK2 controls the expression of E-cadherin by phosphorylating -catenin, the key molecule of Wnt signaling pathway and controls the stability of the snail which is the transcriptional repressor of E-cadherin. Myeloid Zinc Finger 1 (MZF1) is a transcription factor which plays an important role in blood cell development. Recently, it is reported that MZF1 is transcription factor for N-cadherin gene expression in osteoblast along with Sp1. Also, PKCK2 phosphorylation consensus motif was found in MZF-1 and thus, it was examined whether MZF-1 could be one of a substrates of PKCK2 and what could be the impact of MZF-1 phosphorylation by PKCK2 on N-cadherin expression.First, to find which serine / threonine residues within MZF-1 protein can be phosphorylated by PKCK2, KinasePhos2.0 program was used. And then, to confirm that searched residues came through PKCK2 in fact with phosphorylation or not, immunoprecipitation, In vitro kinase assay, and site-directed mutagenesis were performed. Consequently, PKCK2 phosphorylates 27th serine residue of MZF-1. In addition, PKCK2-mediated MZF-1 phosphorylation occurred through a direct interaction with PKCK2. And it was proved through the glutathione S-transferase (GST) pull down assay and immunoprecipitation in vitro and in vivo. Next, to confirm whether PKCK2-mediated MZF-1 phosphorylation affects the MZF-1 protein was examined, western blot analysis and dual luciferase reporter assay were used. When TBB, the specific inhibitor of PKCK2, was treated, expression of the MZF-1 protein was reduced and N-cadherin promoter activity decreased. Also, it was shown that the phenomenon appears equally in the experiment using the S27A, the non-phosphorylated mutant of MZF-1. Taken together, PKCK2-mediated MZF1 phosphorylation directly stabilizes MZF-1 protein. Due to this, the promoter activity of N-cadherin is increased and it controls the E- to N-cadherin switching. Thus, these findings demonstrate that PKCK2 has an effect on the metastasis of cancer cell, ultimately. [한글] 암세포가 전이를 일으키는데 있어 epithelial mesenchymal transition(EMT) 는 중요한 현상이다. 이러한 EMT가 일어나는데 E- to N-cadherin switching은 그 전제조건이 된다. 프로테인 카이네이즈 카제인 카이네이즈2 (PKCK2)는 신호 전달과 무관하게 활성을 갖는 serine/threonine 프로테인 카이네이즈로써 세포 사멸, 세포 생존, DNA 복구 및 세포 주기 조절 등에 관여한다. 최근에 PKCK2가 Wnt signaling pathway의 핵심 인자인 β-catenin을 인산화 시켜 E-cadherin 의 전사 억제자인 snail 의 안정성을 유지시켜 줌으로써 E-cadherin 의 발현을 억제시킨다는 내용이 보고되었다. Myeloid Zinc Finger-1 (MZF-1) 은 혈액 세포 발달에 중요한 역할을 하는 전사 인자인데 최근 보고에 의하면 MZF-1이 osteoblast에서 Sp1과 함께 N-cadherin의 promoter 활성과 단백질 발현을 높인다는 보고가 있었다. 또한 선행 조사 결과 MZF-1에도 PKCK2에 의해 인산화가 일어날 수 있는 보존된 자리가 존재함을 알 수 있었다. 이를 토대로 본 연구에서는 MZF-1과 PKCK2의 관계를 규명하여 보고자 하였다. 먼저 KinasePhos 2.0 프로그램을 통하여 PKCK2에 의하여 인산화가 일어날 수 있는 MZF-1 단백질 내의 serine/threonine 잔기들을 찾아 그들 중 어느 잔기가 실제로 PKCK2에 의해 인산화가 되는지를 면역침전법 및 In Vitro 카이네이즈 분석법, 그리고 돌연변이 분석을 통하여 알아보았다. 그 결과 PKCK2가 MZF1의 27번째 serine 잔기를 인산화 시킨다는 것을 알 수 있었다. 또한 PKCK2에 의한 MZF-1의 인산화가 PKCK2와 MZF-1의 직접적인 상호작용에 의한 것임을 알아내었으며 이는 In Vitro와 In Vivo 상에서 면역침전법을 통해 밝혀냈다. 다음으로 PKCK2에 의한 MZF-1의 인산화가 MZF-1 단백질에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다. PKCK2의 특이적인 억제제인 TBB를 처리하였을 때 MZF-1 단백질의 발현이 감소하였으며 또한 N-cadherin promoter의 활성이 줄어드는 것을 알 수 있었고 이는 MZF-1의 비인산화 돌연변이인 S27A를 이용한 실험에서도 동일하게 나타나는 현상 임을 알 수 있었다. 종합하여 볼 때, PKCK2에 의한 MZF-1의 인산화는 직접적으로 MZF-1 단백질을 안정화 시키고 이로 인해 N-caherin의 promoter 활성을 증가시킴으로 N-cadherin의 발현을 조절하여 E- to N-cadherin switching을 유발하여 궁극적으로는 암세포의 전이에 영향을 준다고 할 수 있겠다.
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