척수손상백서에 BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)와 제대조혈모세포의 이식이 신경계의 기능회복에 미치는 영향

Abstract

[한글]

현재까지 척수손상 후 신경기능을 회복시키고자 하는 수많은 노력이 있었으나, 척수손상치료에는 제한이 있으며, 특히 척수신경조직이 파괴된 경우에는 치료에 한계가 있다.

최근 신경줄기세포가 배양조건에 따라 다양한 세포로 분화가 가능하다는 사실이 알려지면서 신경줄기세포를 이용한 중추신경조직의 재생 연구가 활발하게 진행되어 왔으며 제대조혈모세포를 이용하는 경우 윤리적인 문제점 없이 보다 쉽게 줄기세포를 이용할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 이는 향후 척수손상환자에게 제대조혈모세포를 이용한 척수의 새로운 재생 치료방법을 제시할 수도 있을 것이다.

본 실험은 백서의 흉추부 척수에 중등도의 외상을 가하여 척수손상 백서모델을 만든 후, 1주 후에 손상된 흉추부 척수에 배양 배지만을 투여한 실험대조군을 만들고, 다른 두 집단은 제대조혈모세포를 단독으로 이식하거나 또는 제대조혈모세포와 BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 함께 이식한 후, 백서의 신경학적 기능의 개선을 행동검사로 확인하였다. 이식 8주 후에는 이들의 척수 조직을 채취하여 이식한 제대조혈모세포가 신경계 세포로 분화되었는지의 여부를 이중 면역형광 염색으로 확인하였고, 또한 손상된 축삭이 재생되었는지의 여부를 후향적 수초추적 염색방법으로 확인하였다.

척수손상백서에 제대조혈모세포와 BDNF를 이식한 후 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.

1. 제대조혈모세포를 이식한 경우, 신경학적 기능이 대조군에 비해 통계학적인 유의성은 없었으나 평균적으로 이식 1주 후부터 지속적으로 대조군에 비해 보다 더 개선되었다.

2. 손상 1주 후 제대조혈모세포와 BDNF를 이식한 경우, 이식 1주 후부터 신경학적 기능이 대조군과 제대조혈모세포를 단독으로 이식한 군에 비해 평균적으로 보다 더 개선되었으며 (P<0.05), 이식 8주 후인 최종단계에 있어서도 대조군과 제대조혈모세포를 단독으로 이식한 군에 비해 보다 더 개선되었다 (P<0.001).

3. 제대조혈모세포 이식 8주 후, 이식한 제대조혈모세포가 신경계 세포로 분화되었음을 BrdU (Bromodeoxyuridine)와 GFAP (Glial fibrillary acidic protein) 및 MAP-2 (Microtubule associated protein 2) 이중 면역형광 염색으로 확인하였으며, 또한 투여한 제대조혈모세포내의 신경줄기세포를 Nestin 염색으로 확인할 수 있었다.

4. 제대조혈모세포의 신경계 세포 분화에 있어서 BDNF를 투여한 경우와 투여하지 않은 군 간에 차이는 발견할 수 없었다.

5. 손상된 신경축삭돌기의 재생을 확인하기 위해 후향적으로 축삭돌기를 염색한 결과 제대조혈모세포를 이식한 경우 대조군에 비해 손상된 신경축삭돌기가 더 재생되었고, 특히, BDNF를 함께 투여한 경우는 신경축삭돌기가 보다 더 재생되었음을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로 보아 척수손상부위에 제대조혈모세포를 이식한 경우 이식한 제대조혈모세포가 신경계 세포로 분화되고, 이로 인해 신경학적 기능이 대조군에 비해 보다 더 개선되었으며, 특히, BDNF를 제대조혈모세포 이식과 동시에 투여한 경우는 이식 초기단계부터 신경학적 기능 개선이 더욱 향상되었음을 알 수 있었다.

제대조혈모세포와 BDNF를 함께 이식한 경우 이식한 제대조혈모세포가 신경계 세포로 분화되며, BDNF는 손상된 신경축삭돌기를 보다 더 많이 재생시켜서 신경학적 기능이 점차 회복되는 것을 확인하였다. 하지만, 향후 제대조혈모세포 중 보다 많은 세포가 신경계 세포로 분화할 수 있도록 신경계 세포로의 분화를 촉진시키는 연구와 더불어 손상된 신경축삭돌기가 보다 더 활발하게 회복 및 재생되도록 하는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

[영문]There have been many efforts to recover the neuronal function from spinal cord injuries, but there were some limitations in cases of neural tissue destruction in spinal cord.

Nowadays, the neural stem cell has been noted that it has pluripotency to differentiate into various neural cells. The human umbilical cord blood stem cell is more pluripotent rather than neural stem cell and it also can be more easily obtained. So, the human umbilical cord blood stem cell can be more frequently used for the treatment of spinal cord injured patients in the future.

Moderate degree of spinal cord injured Sprague-Dawley rats were classified to Group A, Media injected into the cord injury site, Group B, Human umbilical cord blood stem cell transplanted into the cord injury site, and Group C, Human umbilical cord blood stem cell with BDNF transplanted into the cord injury site. The BBB locomotion scores was checked to evaluate the functional recovery in 3 groups until 8 weeks after transplantation, and then finally checked neural cell transformation of human umbilical cord blood stem cell with double immunofluorescence staining and axonal regeneration with retrograde labeling of brain stem neurons by fluorogold.

Results were as follows.

1. The human umbilical cord blood stem cell transplanted group was more improved rather than control group in every weeks after transplantation, but it has not significant statistically.

2. The transplanted group with human umbilical cord blood stem cell with BDNF was more improved BBB locomotion score rather than other groups since 1 week after transplantation (P<0.05). And finally, 8 weeks after transplantation, the transplanted group with human umbilical cord blood stem cell with BDNF was more improved BBB locomotion score rather than other groups (P<0.001).

3. The transplanted human umbilical cord blood stem cells were differentiated into various neural cells and it confirmed by double immunoflorescence staining of BrdU and GFAP & MAP-2 staining.

4. The BDNF has no effect on human umbilical cord blood stem cell differentiation to various neural cells.

5. The axonal regeneration was more promoted in umbilical cord blood stem cell with BDNF injection group rather than other groups in the retrograde labeling of brain stem neurons by fluorogold.

Our results demonstrated that human umbilical cord blood stem cell can be differentiate to neural cells and induce motor function improvement in cord injured rat models. Especially, the BDNF has effectiveness of neurological function improvement in early stage of cord injury.

According to these results, the human umbilical cord blood stem cell with BDNF transplantation has recovery effects of the neurological deterioration in early stage of cord injury and repair effects owing to neural cell differentiation of human umbilical cord blood stem cell, and regeneration effects of injured axon. Further study is necessary to enhance a large proportion of stem cells enable to differentiate into neural cells and also enhance the recovery and regeneration of injured axon.